インビトロコロニーアッセイでトライ強力な前駆細胞を特徴付けるための大人のマウスの膵臓から分離されました
Summary
自己再生および成体マウスの膵臓から単離された前駆細胞の分化を検出するためのインビトロコロニーアッセイに考案されています。これらのアッセイでは、膵臓前駆細胞は、メチルセルロースを含む半固形培地中で3次元空間での細胞コロニーを生じます。単一細胞、個々のコロニーの特徴を処理するためのプロトコルが記載されています。
Abstract
幹細胞および成体膵臓の前駆細胞は、1型糖尿病を有する患者を治療するための治療ベータ様細胞の潜在的供給源であり得ます。幹細胞および前駆細胞は、成人の膵臓に存在するかどうかしかし、それはまだ不明です。成体マウスで系譜追跡CRE-LOXを用いた研究戦略は、サポートまたはどちらかがベータ細胞がダクト、成人の膵臓前駆細胞が存在することができると推定位置から生成することができるという考えに異議を唱えることは、結果が得られています。これらのインビボ CRE-LOXの系譜トレースの方法は、しかし、幹細胞を定義するために必要な自己再生および多系列分化-2の基準の質問に答えることはできません。この技術的なギャップに対処を開始するために、我々は、膵臓前駆細胞のための3次元コロニーアッセイを考案しました。すぐに私たちの最初の公開後、他の研究室は、独立してオルガノイドアッセイと呼ばれる類似しているが、同一ではない、方法を開発しました。オルガノイドアッセイと比較して、我々の方法が採用します低濃度で細胞外マトリックスタンパク質の包含を可能にする粘性溶液を形成メチルセルロース、。多くの成人臓器幹細胞の場合のようにメチルセルロースを含むアッセイは、容易に検出及び前駆細胞は、小さなサブ集団を構成する際に重要である、単一細胞レベルでの前駆細胞の分析を可能にします。一緒に、いくつかの研究室からの結果は、in vitro自己再生およびマウスからの膵臓前駆細胞様細胞の多系列分化に実証します。現在のプロトコルは、マウスの膵臓前駆細胞を特徴づけるために、2つのメチルセルロースベースのコロニーアッセイを説明します。 1は、マウスの細胞外マトリックスタンパク質の市販製剤およびラミニンヒドロゲルとして知られている他の人工細胞外マトリックスタンパク質が含まれています。ここに示されている技術は、sの2）単一細胞操作、CD133 +のSox9 / EGFPの膵臓およびソートの1）解離+成体マウスから乳管細胞でありますorted細胞は、3）単一コロニーを、自己再生または分化を評価するために、二次コロニーアッセイにマイクロ流体定量RT-PCRおよびホールマウント免疫染色、および単一細胞懸濁液と再メッキへの一次コロニーの4）解離を使用して分析します。
Introduction
膵臓は、3つの主要な細胞系統で構成されています。腺房細胞が消化酵素を分泌する、ダクトは、病原体をかわすと腸に消化酵素を輸送するためにムチン分泌、および内分泌細胞は、グルコース恒常性を維持し、インスリンおよびグルカゴンなどのホルモンを、分泌します。膵臓の胚発生時には、初期の導管細胞は、成体動物1,2の膵臓に3系統を生じることができるトライ強力な前駆細胞の源です。そのような骨髄幹細胞などの成体幹細胞および前駆細胞は、すでに正常に様々な疾患3を治療するために使用されるので、成体膵臓幹細胞および前駆細胞を見つけることに強い関心があります。成体膵臓幹細胞および前駆細胞の単離および操作が可能であった場合は、これらの細胞は、インスリン分泌細胞は自己免疫によって破壊された1型糖尿病のような疾患を治療するために使用することができます。
<p class = "jove_content">トライ強力な前駆細胞がまだ胚発生完了後の成人膵管内に存在するかどうかは、多額の科学界で議論されている質問です。この議論では、およびin vivoでのcre-LOX系譜追跡技術を使用して、稲田と同僚は、マーカーで標識された大人のマウス膵管細胞、炭酸脱水酵素IIは、すべての3つの膵臓系統4を生じさせることができることを示しました。しかしながら、このようなHNF1b 5とのSox9 2などの他の管のマーカーを使用して、それが管細胞は、成体マウスにおけるβ細胞の主な原因ではないと結論付けられました。数年前、我々は、上記の議論の原因が必要な自己再生および多系列分化二つの基準に測定するために使用することができる適切な分析ツールで、フィールド6,7において、欠如に起因し得ることを提案し幹細胞を定義します。上記のin vivoでのcre-LOXの系統追跡技術上記集団レベルでの前駆-子孫関係の証拠を提供することができます。しかし、この系統のトレース技術は、単一の前駆細胞は、自己再生し、複数の系統に分化することができるかどうかを識別するために、その電力が制限されます。いくつかのモノ強力な前駆細胞、異なる系統の電位のそれぞれが、一緒に分析した場合、それらをまとめて多系列分化能力を持っているように見える可能性があるため、単一細胞分析が重要です。さらに、幹細胞は、通常、成人器官の小集団です。マイナーな細胞集団の活動は、主要な人口でマスクすることができました。したがって、集団研究からの否定的な結果は、必ずしも、幹細胞が存在しないことを示すものではありません。最後に、CRE-LOXの系譜トレースは、現在、自己再生の測定を許可していません。
膵臓前駆細胞生物学、コロニーの分野で技術的なギャップに対処を開始するには7-11またはオルガノイド12月15日 </su三次元培養系を使用してP>アッセイを考案しました。膵臓前駆細胞のための二つのコロニーアッセイは、我々の研究室で開発された：1は、マウスの細胞外マトリックスタンパク質（ECM）（ 方法および装置表を参照）の市販の調製物が含まれ、もう一方はラミニンヒドロゲル、定義された人工的なECMタンパク質7-11が含まれています 。前駆細胞は、メチルセルロースを含む半固形培地中で混合します。メチルセルロースは、木材繊維から調製し、生物学的に不活性粘性材料であり、日常的に、造血コロニーアッセイ16において使用されています。それらは再集合体をできないようにメチルセルロースを含む半固形培地は、単一の前駆細胞の移動を規制します。しかし、培地は、前駆細胞が増殖し、3次元空間における細胞のコロニーに分化させるのに十分柔らかいです。血液学者の伝統に従い、細胞のコロニーを生じさせることができた膵臓前駆細胞は、nでしたアメッド膵臓コロニー形成単位（PCFU）。ネズミECM-含むコロニーアッセイで増殖させた場合PCFUsは、「リング」コロニー7と命名されている嚢胞性コロニーを生じさせます。 Wntアゴニストを添加すると、R-spondin1は、マウスのECM含有培養に、いくつかのリングコロニーを「密」コロニー7に変わります。この記事では、マウスECM培養で生育したコロニーのこれらの2つのタイプをまとめて「リング/高密度」コロニーと呼ばれます。リング/高密度コロニーを単一細胞懸濁液に解離し、ラミニンヒドロゲルを含む培地に再播種するとき、「内分泌/腺房「コロニー7が形成されています。
単一のコロニーを分析使用して、9ネズミ膵臓、のいずれかから大人（2-4ヶ月齢）7,11または若い（1週齢）リング/高密度および内分泌/腺房コロニーの大部分は、3つすべてを表現することが判明しました系統マーカー。これは、発信PCFUsのほとんどがトライ強力であることを示唆しています。ネズミECM-含むコロニーアッセイでは、大人のマウスPCFUsロバスト自己複製と文化7で11週間にわたって約50万回を展開します。ラミニンヒドロゲルの存在下で、ネズミPCFUsは内分泌および腺房細胞と腺管系統7,9,11に非常に少ないに優先的に分化することが奨励されているのに対し、マウスECMは、優先的に、内分泌および腺房系統以上の管細胞の分化をサポートしています。重要なことは、インスリン+グルカゴン–モノホルモンの細胞はラミニンヒドロゲル培養物中で生成され、機能的成熟を 示唆し、 インビトロ 7,9 においてグルコース刺激に応答してインスリンを分泌しています。個々のPCFUsの三系列の分化ポテンシャル7,9および自己再生11は、コロニー形成のためにウェルあたり1細胞を培養すること、 すなわち 、単一細胞マイクロマニピュレーションによって確認されています。一緒に、これらの結果は、自己再生、トリpotenがあるという証拠を提供しますトン、3D培養における活性を示す生後マウスの膵臓内の前駆細胞様細胞。
この資料に記載されたマウスPCFUアッセイは、マウス胚性幹細胞（たmESC）17から分化した前駆細胞のために設計された前コロニーアッセイに由来するものです。そのプロトコルは、別のJoveの出版物18に詳細に記載されています。培養成分及び成人PCFUs用マウスECM含有コロニーアッセイを行うために必要な技術は、MESC由来前駆17,18と同じです。したがって、アッセイのこれらの側面は、ここでは繰り返さないことにします。代わりに、次の手順では、対処されることになります：1）成人の膵臓の解離および成体マウス7、2）選別された細胞の単一細胞操作、3）シングルコロニーからPCFUsを豊かCD133 +のSox9 / EGFP +管細胞を、ソーティングマイクロ流体定量RT-PCRおよびホールマウント免疫染色を用いて分析し、コロニーの4）解離単一細胞懸濁液にsおよびマウスECMまたはラミニンヒドロゲルコロニーアッセイに再メッキ。
Protocol
Representative Results
Discussion
膵臓コロニーアッセイおよび単一コロニーをここで説明する分析は、過去数十年23中の造血前駆細胞の生物学を解読で主要な役割を果たしてきたメチルセルロースを含む、造血コロニーアッセイに触発されました。これらのアッセイ（ 図5）において、膵臓細胞を適切な成長因子およびECMタンパク質のリングの形成をサポートする、高密度または内分泌/腺房コロニー7<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、ソートの支援のための希望の都市で分析サイトメトリーコアからルーシー・ブラウンとアレクサンダースパッラに感謝します。この作品は、国立衛生研究所によって部分的にサポートされている（NIH）ADRにHTKにR01DK081587とR01DK099734を付与し、U01DK089533、国立科学財団助成金NSF-DMR-1206121及び再生医療のためのカリフォルニア工科大学によってDATにRB5-07398を付与サポートジョセフ・J・ジェイコブスDATにカリフォルニア工科大学で医学のための分子工学研究所、およびオックスナード財団とエラ・フィッツジェラルド財団からのものからHTKにも深く感謝しています。
資金調達：この作品は、国立衛生研究所によって部分的にサポートされている（NIH）ADRにR01DK081587とR01DK099734 HTKに、とU01DK089533を付与し、国立科学財団の助成によりNSF-DMR-1206121及び再生医療のためのカリフォルニア工科大学にRB5-07398を付与DATは、ジョセフ・J・ジェイコブスからサポートDATにカリフォルニア工科大学で医学のための分子工学研究所、およびオックスナード財団とHTKのエラ・フィッツジェラルド財団からのものも深く感謝しています。この刊行物で報告された研究は、受賞数P30CA33572の下で国立衛生研究所の国立癌研究所によってサポートされている分析サイトメトリーコアと光学顕微鏡デジタルイメージングコアで実行される作業が含まれていました。
研究のスポンサー：スポンサーは、研究デザイン、収集、分析、またはデータの解釈に参加しませんでした。
Materials
| Murine ECM proteins (Matrigel) | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 354230 | Stock kept at -20oC |
| Laminin Hydrogel | Provided by David Tirrell (Pasadena, CA USA) | Stock kept at -20oC | |
| Methylcellulose | Shinetsu Chemical (Tokyo, Japan) | 1500 centipoise (dynamic viscosity unit equal to 15g/cm/s) (high viscosity) | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Mediatech (Manassas, VA, USA) | 21-031-CV | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | |
| 50mL Flacon Conical vial | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 352070 | |
| 100mmx20mm Suspension culture dish | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 430591 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | A8412 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | |
| DNase1 | Calbiochem (Darmstadt, Germany) | 260913 | |
| Collagenase B | Roche (CH-4070, Basel, Schweiz, Switzerland) | 11088831001 | Stock kept at -20oC |
| Anti-mouse CD16/32 | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 101310 | low endotoxin, azide free |
| PE-Cy7 Rat IgG2a κ Isotype Control | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 400522 | |
| Rat IgG1 κ Isotype Control | eBioscience (San Diego, CA, USA) | 13-4301-82 | |
| Anti-CD133-Biotin | eBioscience (San Diego, CA, USA) | 13-1331-82 | |
| Anti-CD71-PE-Cy7 | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 113812 | |
| Streptavidin-Allophycocyanin | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 405207 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | 3571 | Stock kept at -20oC |
| Anti-mucin 1 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA USA) | HM-1630-P1 | |
| Dylight 649 Goat anti-Armenian Hamster | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 127-495-160 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Mediatech(Manassas, VA, USA) | 10-092-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Tissure Culture Biologicals (Long Beach, CA, USA) | 101 | Stock kept at -20oC |
| Tris Ethylenediaminetetraacetic acid | TEKnova (Hollister, CA, USA) | T0221 | |
| Rneasy Micro Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 74004 | |
| QuantiTec Reverse Transcription Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 205310 | |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Ambion/Invitrogen(Grand Island, NY, USA) | 11753-100 | |
| Paraformaldehyde | Santa Cruz Bio (Santa Cruz, CA, USA) | SC-281692 | |
| Goat serum | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 005-000-121 | Stock kept at -20oC |
| Donkey serum | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 0017-000-121 | Stock kept at -20oC |
| Triton X-100 | Sigma (St. Louis, MO, USA) | T9284 | |
| Trypsin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | T-4799 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | 15575-020 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies (Waltham, MA, USA) | 25200-056 | |
| Sterile Water | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15230-147 | Molecular biology grade |
| Pasteur Pipette | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 13-678-8B | |
| 40um Filter Mesh | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 08-771-1 | |
| 70 um filter mesh | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 08-771-2 | |
| TC Plate 96 Well Suspension | Sarstedt | 83.3924 (Previously 83.1835) | |
| 1cc Syringe | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 309659 | |
| 10cc Syringe | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 301604 | |
| 48.48 Dyanmic Array Chip | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | BMK-M-48.48 | |
| Fluidigm GE 48.48 Dynamic Array Sample & Assay Loading Reagent Kit | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | 85000800 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems (Grand Island, NY, USA) | 4304437 | |
| Polyethylene glycol sorbitan monolaurate | Sigma (St. Louis, MO, USA) | P7949 | |
| Glass Bottom Dish | MatTek (Ashland, MA, USA) | P35G-1.5-14-C | 35 mm petri dish with glass bottom |
| Mouth Piece/ Rubber Tubing | Renova Life Inc. (College Park, MD, USA) | MP-SET | |
| Nicotinamide | Sigma (St. Louis, MO, USA) | N0636 | Stock kept at -20oC |
| Vascular Endothelial Growth Factor | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 293-VE | Stock kept at -80oC |
| Activin B | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 659-AB | Stock kept at -80oC |
| Extendin 4 | Sigma (St. Louis, MO, USA) | E7144 | Stock kept at -20oC |
| Rspondin-1 | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 3474-RS | Stock kept at -80oC |
| Falcon 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 352054 | |
| PrecisionGlide Needle 18Gx1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 305196 | |
| PrecisionGlide Needle 16Gx1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 305198 | |
| Costar Ultra-Low Attachment Surface 24 well flat bottom plate | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 3473 | |
| Costar 96 Black Well Plate | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 3603 | Flat, clear bottom with lid. Black polystyrene TC-treated microplates |
| Zeiss LSM510 META NLO Axiovert 200M Inverted Microscope | Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany) | ||
| Biomark HD | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | ||
| Aria Special Order Research Product Cell Sorter | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) |
References
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