Modélisation de la dystrophie myotonique 1 dans les cellules C2C12 myoblastes
Summary
Dans ce protocole, nous présentons les procédures pour établir la dystrophie 1 modèles de myoblastes myotonique, y compris la maintenance optimisée C2C12 cellulaire, la transfection de gènes / transduction, et la différenciation des myocytes.
Abstract
La dystrophie myotonique 1 (DM1) est une forme courante de dystrophie musculaire. Bien que plusieurs modèles animaux ont été établis pour DM1, les modèles de cellules myoblastes sont encore importants, car ils offrent une alternative cellulaire efficace pour étudier les événements cellulaires et moléculaires. Bien que les cellules de myoblastes C2C12 ont été largement utilisés pour étudier la myogenèse, la résistance à la transfection de gènes, ou une transduction virale, empêche la recherche dans des cellules C2C12. Ici, nous décrivons un protocole optimisé comprenant des procédures d'entretien quotidien, la transfection et de transduction pour introduire des gènes dans des myoblastes C2C12 et l'induction de la différenciation des myocytes. Collectivement, ces procédés permettent de meilleurs rendements de transfection / transduction, ainsi que des résultats de la différenciation cohérente. Le protocole décrit dans l'établissement de modèles de cellules myoblastes DM1 bénéficierait l'étude de la dystrophie myotonique, ainsi que d'autres maladies musculaires.
Introduction
La dystrophie myotonique (DM) est une maladie autosomique dominante qui affecte plusieurs systèmes, plus particulièrement les muscles cardiaques et squelettiques 1. Il existe deux sous-types de cette maladie, DM1 et DM2. DM1 est plus fréquente et a une manifestation plus sévère que DM2 2. La mutation génétique sous – jacente DM1 est une expansion de répétitions de triplets CUG situées dans la région 3 'non traduite (UTR) du gène de la protéine kinase de DM (DMPK) 3. Le nombre de répétitions CUG dans les individus non affectés varie de 5 à 37. En revanche, elle augmente à plus de 50, et parfois jusqu'à des milliers de patients DM1 4. En conséquence, les protéines liant l'ARN, tels que muscleblind-like 1 (MBNL1), CUGBP et Elav comme la famille 1 (Celf1), sont misregulated. En raison de la séquestration des répétitions CUG expansées, MBNL1 perd sa capacité à réguler 5 l' épissage alternatif. Celf1, d'autre part, est régulée à la hausse de 6,7. La surexpression de Celf1 est associée à la perte de muscleet la faiblesse, qui ne sont pas attribués à la perte de la fonction MBNL1. Les modèles animaux simulant des altérations DM1-connexes, y compris DMPK 3'-UTR extension CUG, la perte de MBNL1, et la surexpression de Celf1, ont été établis. Cependant, la modélisation DM1 dans les myoblastes offre une alternative efficace, en particulier pour disséquer les événements cellulaires et moléculaires DM1 liées.
C2C12 lignée cellulaire de myoblastes a été isolé à partir du muscle de souris C3H blessés et largement utilisé pour étudier la différenciation myogénique 8,9. les cellules C2C12 prolifèrent rapidement dans le sérum de fœtus bovin (FBS) contenant des médias et facilement subissent une différenciation lorsque FBS est épuisée. Pourtant, l'utilisation de ce modèle de différenciation des myoblastes présente deux difficultés: Des cellules C2C12 sont souvent résistantes aux gènes de transfection / transduction virale; et de légères variations dans la manipulation des cellules et de la procédure de différenciation peut conduire à des changements marqués dans la formation de myotubes.
Notre laboratoire utilise régulièrement myoblastes C2C12 comme acmodèle et ell a développé des protocoles qui fournissent efficacement des gènes par transfection plasmidique, la transduction rétrovirale et lentiviral transduction en C2C12 lignée cellulaire 10. Dans la vidéo, nous démontrons les procédures optimisées pour la transfection / transduction C2C12 cellules et le maintien de la cohérence de la différenciation dans l'établissement de modèles de myoblastes DM1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lignée cellulaire C2C12 a été utilisé comme modèle pour étudier la myogenèse 11-14. Ces cellules conservent un aspect fibroblaste, prolifèrent rapidement dans les milieux contenant 20% de sérum fœtal bovin et facilement différencier dans un milieu contenant 2% de sérum équin 15. La croissance rapide et la différenciation sont des caractéristiques avantageuses dans un modèle cellulaire de la myogenèse. Ici, nous démontrons l'utilisation du plasmide, rétroviral et vecteurs lent…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Drs. Tom Cooper from the Baylor College of Medicine, Mani S. Mahadevan from the University of Wisconsin-Madison, and Didier Trono from the University of Geneva for reagents. This work is supported by a University of Houston startup fund (YL), American Heart Association grant (YL, 11SDG5260033), and the National Natural Science Foundation of China (XP, 81460047).
Materials
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-084 | for culture medium |
| Fetal Bovine Serum – Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | for culture medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Life Technologies | 10378-016 | for culture medium |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma Aldrich | I6634-100MG | for differentiation medium |
| equine serum | Atlanta Biologicals | S12150 | for differentiation medium |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | for transfection |
| G418 sulfate | Gold Biotechnology | G-418-10 | for drug resistant selection |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | sc-108071 | for drug resistant selection |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | for western blot |
| NuPAGE Transfer Buffer (20X) | Life Technologies | NP00061 | for western blot |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20X) | Life Technologies | NP0002 | for western blot |
| Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300mmx4m | GE healthcare life science | 10600015 | for western blot |
| MF 20 | Developmental Hybridoma Bank | MF 20 | primary Ab for immunostaining |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Texas Red-X conjugate | Thermo Fisher Scientific | T-862 | secondary Ab for immunostaining |
| One step qRT-PCR MasterMix | AnaSpec | 05-QPRT-032X | for qRT-PCR |
| TriPure Isolation Reagent | Roche | 11667165001 | for RNA isolation |
| CUG-BP1 Antibody (3B1) | santa cruz | sc-20003 | primary Ab western blot |
| Actin Antibody | santa cruz | sc-1615 | goat polyclonal IgG for loading control |
| 293T Ecopack | Clontech | 631507 | cells for retrovirus preparation |
| pMSCV-puro | Clontech | 634401 | empty retroviral vector for retrovirus preparation |
| pMSCV-Celf1Flag-puro | house-constructed | not available | retroviral vector encoding Celf1Flag, used in retrovirus preparation |
| psPAX2 | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| pMD2.G | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| GFP-CUG5 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| GFP- CUG200 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | for immunostaining |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | for immunostaining |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P9416 | for immunostaining |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | for immunostaining |
References
- Harper, P. S. . Myotonic dystrophy. 3rd edn. , (2001).
- Timchenko, L. Molecular mechanisms of muscle atrophy in myotonic dystrophies. Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2280-2287 (2013).
- Brook, J. D., et al. Molecular basis of myotonic dystrophy: expansion of a trinucleotide (CTG) repeat at the 3′ end of a transcript encoding a protein kinase family member. Cell. 68 (4), 799-808 (1992).
- Chau, A., Kalsotra, A. Developmental insights into the pathology of and therapeutic strategies for DM1: Back to the basics. Dev Dyn. 244 (3), 377-390 (2015).
- Ho, T. H., et al. Muscleblind proteins regulate alternative splicing. EMBO J. 23 (15), 3103-3112 (2004).
- Kuyumcu-Martinez, N. M., Wang, G. S., Cooper, T. A. Increased steady-state levels of CUGBP1 in myotonic dystrophy 1 are due to PKC-mediated hyperphosphorylation. Mol Cell. 28 (1), 68-78 (2007).
- Kalsotra, A., et al. The Mef2 transcription network is disrupted in myotonic dystrophy heart tissue, dramatically altering miRNA and mRNA expression. Cell Rep. 6 (2), 336-345 (2014).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
- Blau, H. M., Chiu, C. P., Webster, C. Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons. Cell. 32 (4), 1171-1180 (1983).
- Peng, X., et al. Celf1 regulates cell cycle and is partially responsible for defective myoblast differentiation in myotonic dystrophy RNA toxicity. Biochim Biophys Acta. 1852 (7), 1490-1497 (2015).
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S. The myotonic dystrophy expanded CUG repeat tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast differentiation. Hum Mol Genet. 10 (18), 1879-1887 (2001).
- Amack, J. D., Paguio, A. P., Mahadevan, M. S. Cis and trans effects of the myotonic dystrophy (DM) mutation in a cell culture model. Hum Mol Genet. 8 (11), 1975-1984 (1999).
- Bhagavati, S., Shafiq, S. A., Xu, W. (CTG)n repeats markedly inhibit differentiation of the C2C12 myoblast cell line: implications for congenital myotonic dystrophy. Biochim Biophys Acta. 1453 (2), 221-229 (1999).
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S. Myogenic defects in myotonic dystrophy. Dev Biol. 265 (2), 294-301 (2004).
- Emerson, C. P., Sweeney, H. L. . Methods in muscle biology. 52, (1997).
- Ward, A. J., Rimer, M., Killian, J. M., Dowling, J. J., Cooper, T. A. CUGBP1 overexpression in mouse skeletal muscle reproduces features of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19 (18), 3614-3622 (2010).
- Koshelev, M., Sarma, S., Price, R. E., Wehrens, X. H. T., Cooper, T. A. Heart-specific overexpression of CUGBP1 reproduces functional and molecular abnormalities of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19 (6), 1066-1075 (2010).
