This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.
Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.
Sinir yaralanmalarının ise, yakın ve uzak sinir kütükleri çoğu zaman lezyon yerinde 1-2 sinir liflerinin direkt yeniden düzenlenmesi engellenir. Normalde, akson yolları bağlantı karmaşık ağlar oluşturan aksonların çok düzenli ve uyumlu demetleri, oluşmaktadır. Ancak, sinir rejenerasyonu kötü organize akson hizalama 3-4 dolayı kaotik bir süreçtir. Bu nedenle, lezyon yerinin köprü aksonlar rejenere yeterli bir sayı üretmek için, iyi organize aksonal hizalanma yaratmak için de gereklidir. Ayrıca, demiyelinizasyon yaralanma yerinde myelinating hücrelerin ölümüne bağlı sinir yaralanmaları eşlik eder. Demiyelinizasyon kuvvetle aksonlar hayatta iletken kapasitesini bozar yana, demiyelinizasyon hedefleme veya yeniden miyelin oluşumunu teşvik tedaviler sinir hasarı 5 sonra fonksiyonel iyileşme için önemlidir. Dolayısıyla, bu protokolün amacı, bu iki konuyu ele alan bir mühendislik yaklaşımı göstermektirSinir rejenerasyon.
Bir malzemenin fiziksel ve mekanik özellikleri, farklı eksenler boyunca ölçüldüğünde, bir fark olarak tanımlanan yüzey anizotropi, hücre hizalama, büyüme ve taşıma 6-7 etkilemek için uygulanmaktadır. topografya ek olarak, anizotropi indükleme için diğer yöntemler bulunmaktadır. Daha önce, poli-dimetil-siloksan (PDMS) membranın mekanik statik ön streç neden olduğu yüzey anizotropi incelenmiştir. "Büyük uygulanan küçük deformasyon süper" teorisi hücreleri gerilmiş yönde anlamda etkili bir sertliği dik yönde farklıdır tahmin ve etkin sertlikteki bu fark anizotropi 8 yüzey kaynaklanmaktadır. Önceden gerilmiş PDMS zar üzerinde kültürlenmiş mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) aktif yüzeyi çekerek ve bunun sonucu olarak anizotropiye duyu önceden gerilmiş yönde 9 hizalamak edebiliyoruz. Benzer şekilde, anizotropik yüzey armekanik ön-gerilmiş yüzeyinden ising sırt kök gangliyonu hizalamasını yanı sıra büyüme ve miyelinasyonun (DRG) 10 aksonlar etkiler. Burada akson rejenerasyonu 10 artırmak için statik bir önceden gerilmiş PDMS substrat yüzey anizotropi uyarılması için bir protokol sağlar.
Akson hizalama, istenilen desenleri ile topolojik özellikleri ortaya çıkarmak için, hizalanmış lifleri ve kanallar 6,11-12 ile temas rehberlik sağlamak için rapor, akson hizalama 11,13 kolaylaştırmak için ortaya konmuştur. Ancak, bu tür lifleri, kanallar ve desen olarak topolojik özellikler aracılığıyla akson hizalama uyarılması için teknikler bildirdi uzatmak ve akson kalınlığını artırmak için koyamadık. Tersine, mekanik kademeli bir esneme 14 büyüklüğü arttı daha uzun ve daha kalın akson streç yönünde akson hizalama yol germe. Bununla birlikte, in vivo koşullarında, bir çalışan motorlu cihazı içeren değildirmümkün. Bunun aksine, statik önceden gerilmiş neden anizotropi daha az karmaşık ve daha kolay bir şekilde in vivo uygulamalar için gelecekteki iskele tasarımlar içine dahil edilebilir.
Bu protokol, statik önceden gerilmiş hücre kültür sistemi topolojik özellikler olmadan yüzey anizotropi indüklemek için kullanılır. Membran çerçevesi üzerine sabitlenir ve önceden tespit edilmiş bir germe büyüklüğü germe aşaması uygulanır, bunun üzerine önceden gerilmiş kültür sistemi, PDMS zar, bir gerilebilir çerçeve ve bir germe aşamasında oluşmaktadır. 21 güne kadar önceden gerilmiş yüzünde kültür taze izole DRG nöronları akson hizalama ve kalınlık için izlenir. Daha sonra, Schwann hücreleri (SCS) miyelinasyon izlenir hizalanmış aksonlar ile birlikte kültürlendi. Ön streç kaynaklı yüzey anizotropi birleşmeyle biz MSC ve DRG nöronlarının sırasıyla 9-10, hücre hizalama farklılaşma ve akson hizalama büyümeyi artırmak başardık.
önceden gerilmiş bir yüzeye akson hizalama teşvik etmek için, iki kritik adımlar vardır: 1) PDMS zarı ve homojen kalınlıkta düz olmalıdır; ve 2) glia hücreleri DRG uzaklaştırılmalıdır. PDMS ve çapraz bağlayıcı karıştırma ve bir fırında kür sonra, çapraz PDMS jel düz bir tezgah üstünde tutulur ve herhangi bir eğilmesini önlemek için dikkatle ele alınmalıdır. Plazma tedaviden sonra (hücre bağlanması için gerekli olan) sert yüzeye adsorbe zamanla azaltır çünkü PDMS dokunun ok…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar PDMS alt tabakaların hazırlanmasında yaptığı yardım için Eric Vasco teşekkür etmek istiyorum, yararlı öneriler ve DRG izolasyon eğitimi için Michigan Üniversitesi'nden Dr. Marina Mata'nın laboratuarında Dr. Shiyong Wang ve Dr. Mark Tuszynski ve Dr . UC San Diego W. Marie Campana SC izolasyonu için yararlı öneriler ve protokol için. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (CBET 0941055 ve CBET 1510895), Ulusal Sağlık Enstitüsü (R21CA176854, R01GM089866 ve R01EB014986) tarafından kısmen desteklenmiştir.
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
Neurobasal Medium 1X | GibcoBRL | 21103-049 | |
B27 Supplement 50X | GibcoBRL | 17504-044 | |
Glutamax-I 100X | GibcoBRL | 35050-061 | |
Albumax-I | GibcoBRL | 11020-021 | |
Nerve Growth Factor-7S | Invitrogen | 13290-010 | |
Penicillin-streptomycin | GibcoBRL | 15140-122 | |
0.05% Trypsin-EDTA/1mM EDTA | GibcoBRL | 25300-054 | |
Poly-L-Lysine | Trevigen | 3438-100-01 | |
Poly-D-Lysine | Sigma | p-6407 | |
Fluoro-2 deoxy-uridine | Sigma | F0503 | |
Uridine | Sigma | U3003 | |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170-112 | Isolation Buffer |
Type I Collagenase | Worthington | LS004196 | |
DMEM | Gibco | 11885 | |
Heat inactivated Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30080.03 | |
BPE | Clonetics | CC-4009 | |
Forskolin | Calbiochem | 344270 | |
Silicone chamber | Greiner bio-one | FlexiPERM ConA | |
Plasma cleaning/etching system | March Instruments | PX-250 | |
Anti-Thy 1.1 antibody | Sigma- Aldrich | M7898 | |
Rabbit Complement | Sigma- Aldrich | S-7764 | |
Standard growth medium | For 500 ml Neurobasal Medium 1X, add 10 ml of B-27 50X, 5 ml of Glutamax-I 100X, | ||
2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF– 7S (50 ug/ml). | |||
FDU and Uridine stock solution | FDU 100mg in 10ml of ddw (10mg/ml), filter in the hood and divided in 500ul aliquots and store at -20 ºC. | ||
Uridine 5g in 166.7ml of ddw (33mg/ml), filter in hood, divide in 200ul aliquots and store at -20 ºC. | |||
Take 61.5ul of FDU (10mg/ml) and 20.5ul of Uridine(33mg/ml), and add 4918ul of ddw to a final stock concentration, | |||
then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC. |