Abstract
O isolamento do vírus gigantes é de grande interesse nesta nova era de virologia, especialmente desde que estes vírus gigantes estão relacionados com protistas. vírus gigantes podem ser potencialmente patogênicos para muitas espécies de protistas. Eles pertencem à ordem descrita recentemente de Megavirales. A nova linhagem Faustovirus que foi isolado a partir de amostras de esgoto está distantemente relacionado com o agente patogénico de mamífero suíno Africano vírus da peste. Este vírus também é específico para o seu hospedeiro amébica, vermiformis Vermamoeba, um protista comuns em sistemas de água de cuidados de saúde. É crucial para continuar a isolar novos genótipos Faustovirus, a fim de ampliar sua coleção genótipo e estudar a sua pan-genoma. Nós desenvolvemos novas estratégias para o isolamento de estirpes adicionais, melhorando a utilização de combinações de antibióticos e antifúngicos, a fim de evitar as contaminações bacterianas e fúngicas da co-cultura ameba e favorecendo a multiplicação do vírus. Além disso, implementamos um novo starvation forma a manter V. vermiformis em condições óptimas para vírus co-cultura. Finalmente, utilizou-se citometria de fluxo em vez de observação microscópica, o que é moroso, para detectar o efeito citopatogénico. Obtivemos dois isolados de amostras de esgoto, comprovando a eficiência deste método e alargando, assim, a coleção de Faustoviruses, para entender melhor seu ambiente, especificidade do hospedeiro e conteúdo genético.
Introduction
A descoberta de vírus gigantes, especialmente aquelas que pertencem à ordem Megavirales, mudou completamente o mundo dos vírus em termos de tamanho de partícula e a complexidade do genoma. Os vírus foram previamente pensado para ser pequenas entidades, ea Mimivírus apareceu para quebrar todas as regras. 1 dados metagenômica sugere a ubiquidade dos vírus gigantes não só no ambiente, 2-5, mas também em seres humanos. 6 Portanto, ainda há uma necessidade de pesquisa para estes vírus em grande escala. A diversidade destes vírus gigantes foi avaliada por amostragem não só uma variedade de ambientes aquáticos e dos seus sedimentos associados em todo o mundo, 7-11, mas também por rastreio de uma variedade de amostras humanas 12,13 e amostras ambientais. Os 7,9 Mimivírus Polyphaga foi Acanthamoeba isolado por co-cultura utilizando protistas fagocíticas, principalmente Acanthamoeba spp. 14-16 Uma coleção inteira de vírus gigantes eram, então, tambémisolado a partir deste host protista especificado, o que fez a comunidade científica restringir o seu procedimento de pesquisa e isolamento de Acanthamoeba spp. É evidente que esta dependência de uma única espécie de hospedeiro resultou em uma grande fração de vírus que está sendo negligenciado. O fato de que o vírus gigante, CroV, foi isolado com o altamente móveis marinho roenbergensis protozoários Cafeteria, 17,18 demonstra a necessidade de usar uma ampla gama de protozoários, a fim de descobrir novas linhagens ou famílias de vírus gigantes. Reteno et al. Conseguiram selecionar outros protozoários como hospedeiros celulares que nunca tinha sido utilizado anteriormente, e isolado da nova linhagem relacionados com Asfar de vírus gigantes (o recém-nomeado Faustovirus). 19
Em uma tentativa para isolar novos genótipos Faustovirus a fim de expandir os membros desta linhagem viral, modificamos nossos procedimentos de isolamento e os usou para selecionar amostras ambientais capazes de colher novas Faustoviruses. Nós entãodescrito todo o protocolo para caracterizar os novos isolados. Foram avaliados vermiformis Vermamoeba, o protista de vida livre mais comum encontrado em ambientes humanos, 20-22 que já é utilizado no isolamento do primeiro protótipo Faustovirus E12. 19 Esta protista está ainda hospedar-específico para Faustovirus. Sabíamos que nenhum dos vírus gigantes conhecidos foi patogênico para esta ameba, porque nenhuma tentativa para crescer outros vírus gigantes em nosso laboratório mostraram lise ameba ou o crescimento viral. Por esta razão, nós acreditamos que V. vermiformis é o melhor e mais original suporte de células conhecidas para isolar novos Faustoviruses.
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Protocol
Coleção 1. Amostra
- Colete 70 amostras de diferentes ambientes e regiões. Neste caso, use os seguintes: 5 amostras de água sujas da aldeia de Saint Pierre de Meyzoargues (França), 15 amostras do lago em Parc Borély em Marselha (França); 15 amostras de água do mar com sedimentos das enseadas rochosas em Samena em Marselha (França), 25 amostras de água do rio dos Alpes (França), e, finalmente, 10 amostras de esgoto em La Ciotat (França).
- amostras vortex por homogeneização antes de inocular, durante um minuto à temperatura ambiente, sem qualquer tratamento.
2. Processo de isolamento
- Hospedar Preparação para procedimentos de cultura cego e Inoculação Amostra
- Use V. vermiformis (estirpe CDC19) na forma de um suporte celular para a co-cultura.
- Manter as amebas a 28 ° C, num balão de cultura de 75 centímetros de células 2 com 30 ml de protease peptona-extracto de levedura-glicose médio (PYL). Por favor, verifique a composição PYG na Tabela 1.
Nota: Após 48 horas, as amebas são quantificados por uma contagem usando lâminas de contagem normais (por exemplo, Kovaslides). - Células colheita a uma concentração de 5 x maio 10-junho 10 células / ml, e sedimento amebas por centrifugação a 720 xg durante 10 min.
- Remover o sobrenadante por aspiração, e re-suspender o sedimento amebas em 30 ml de solução salina estéril amébica da página (PAS) Tabela 1. Repetir este procedimento de lavagem.
- Re-suspender amebas em 30 ml de meio de privação com uma mistura antibiótica e antifúngica numa concentração de cerca de 10 6 / ml amiba. O meio de inanição é um meio de sobrevivência para a ameba, permitindo-lhe manter vivo sem encistamento ou multiplicação. Verificar composição na Tabela 1.
Nota: A mistura de agente antimicrobiano continha 10 ug / ml de vancomicina, 10 ug / ml de imipenem, 20 ug / ml de ciprofloxacina, 20 μg / ml de doxiciclina, e 20 ug / ml de voriconazol. Esta mistura serviu para reduzir a contaminação bacteriana e fúngica, que pode diminuir ou alterar a multiplicação virai. - Directamente inocular 25 uL de cada amostra sobre a ameba monocamada de 200 ul num fundo plano de 96 poços da placa favorecendo a adesão ameba e incubar a 30 ° C num ambiente húmido (num ambiente húmido consiste na colocação de uma compressa molhada no interior do saco que contém o placa, a fim de evitar a evaporação). Este é o primo-cultura. Deixar dois poços de amebas sem qualquer inoculação da amostra; este actua como o controlo negativo. Incubar esta cultura primo por três dias.
- Três dias após a primeira inoculação, sub-cultura da placa primo-cultura em amebas fresco como descrito acima, sem qualquer observação microscópica. Incubar a placa de novo por três dias, sob as mesmas condições que o primo-cultura.
- Realizar a cultura final após três dias de incubação da mesma forma que para the primo- e sub-cultura. Incubar a cultura final para dois dias. Em seguida, proceder à detecção.
- Detecção de lise por Citometria de Fluxo automatizado
Nota: cultura cego acoplado com a citometria de fluxo difere do sistema padrão anterior de isolamento. É mais sensível, preciso e automatizado. Para fins de detecção, aplicou-se uma nova técnica desenvolvida para detectar lise na maior velocidade e sem observação microscópica. Esta técnica é vantajosa para amostras de triagem e tem melhor sensibilidade do que técnicas mais antigas 7-9.- Utilizar a placa de 96 poços de co-cultura final para detectar lise.
- Ligue o citômetro e executar um ciclo de limpeza e lavagem, a fim de obter menor ruído de fundo de acordo com o protocolo do fabricante.
- Inicie o High Throughput Sampler (HTS) combinados com citômetro de fluxo para carregar automaticamente amostras da placa de 96 poços e realizar uma aquisição totalmente automatizado dentro de 40 min according com o protocolo do fabricante.
- Configure os HTS da seguinte forma: o volume de amostra de 150 mL, misturando volume de 50 ul, de mistura de velocidade 180, número de misturas 5, o volume de lavagem entre cada mL da amostra 400, taxa de fluxo de 2,5 l / s, número de eventos registrados 10.000.
- Avaliar os poços de controlo negativos da co-cultura de micro-placa final, em primeiro lugar, a fim de portão da população ameba e para determinar a percentagem destas células hospedeiras de acordo com as suas características físicas. Certifique-se de ter uma população homogênea ameba e uma segunda população de um eventos inferiores correspondentes a resíduos e ruído.
Nota: Este procedimento gating distingue detritos subcelular e aglomerados de células individuais por tamanho, estimados pela dispersão para a frente. Portanto, é importante para determinar com precisão a percentagem de cada população usando o melhor procedimento gating possível. Estas percentagens podem variar, especialmente se são utilizados diversos tipos de protozoários, por isso, é importante sempre ter um negative controlo, que podem ser utilizados como a população referência para o resto das amostras. - Comece o gating clicando amostra de aquisição.
- Grave o número de eventos não menos de 10.000 eventos.
- Localizar a população ameba de interesse usando a seta. Esta é a forma de definir as portas.
- Depois de gating, deixe o local HTS ou localizar a placa clicando em 'Home', em seguida, executar toda a placa automaticamente. Execute aquisição e análise de dados de acordo com o tamanho ea estrutura parâmetros (respectivamente, FSC (dispersão para a frente) e SSC (dispersão lateral)).
Nota: A detecção da perda da população gated-amiba sinaliza a presença de um agente patogénico responsável pela lise amiba. lise protozoários associada com a infecção pelo vírus é detectado com um limiar arbitrariamente concebido de 50% de lise da população ameba fechado pelo analisador e comparada com a mesma população não-infectado utilizado como um controlo negativo fiável.
- Coloração preliminar para revelar a presença de vírus gigantes
- Após a detecção de lise por citometria de fluxo, Pipeta as co-culturas lisadas para suspender as amebas restantes. Em seguida, directamente Cytocentrifuge 50 ul da suspensão a 800 xg durante 10 min.
- Após a centrifugação, corrigir as lâminas com uma solução de metanol puro. Manchar os slides usando uma coloração comercial rápida de Eosina / azul Azur e DAPI coloração e observar ao microscópio óptico de 1000X ampliação, a fim de verificar a presença de vírus fábricas.
- Para a coloração rápida, mergulhar as lâminas para a primeira solução de eosina (4 s repetidos três vezes), em seguida, passar directamente para mergulhar as lâminas para a segunda solução de fixação contendo azul Azul durante 6 seg, e, finalmente, enxaguar as lâminas durante 45 s com uma solução tampão de fosfato pH 7,2. Deixe os slides para secar em temperatura ambiente, em seguida, proceder à observatiem.
- Para a coloração DAPI, depósito de 15 ul da solução-mãe comercial DAPI sobre a lâmina fixa seco. Proteger da luz, em seguida, proceder à observação.
- Microscópio eletrônico
- Após a primeira identificação nos slides, avaliar a presença do vírus gigante através da observação microscopia eletrônica de culturas sobrenadante.
- Depósito de 5 ul da amostra positiva para a grade descarregada-brilho. Esperar durante aproximadamente 20 min a temperatura ambiente.
- Seca-se a grelha com cuidado e depósito em que uma pequena gota de 1% de molibdato de amónio durante 10 seg. Deixar a grelha secar durante 5 min.
- Proceder à microscopia eletrônica em 200 keV.
- Coloque a grelha no suporte; introduzir o suporte no microscópio. Verificar a visão geral de vácuo, clicando no ícone correspondente. Feche as válvulas e começar a observação em um tamanho de ponto 5, e ampliação de x 25.000.
- Meça o vírus gigante usando ImageJ ou diretaLY no microscópio usando a ferramenta de medida do microscópio localizado na tela de aquisição.
Nota: classificar a amostra para o grupo Faustovirus com um tamanho da cápside de aproximadamente 200 nm.
- Biologia molecular
Nota: Após essa identificação, testes de biologia molecular foram cruciais para a confirmação para distinguir Faustovirus de marseillevirus, que tem o mesmo tamanho do capsídeo e aparência em microscopia eletrônica, embora eles não têm a mesma especificidade de acolhimento. O marseillevirus não pode crescer em Vermamoeba, o Faustovirus é específico para Vermamoeba e todas as tentativas para ele crescer em outros ameba como Acanthamoeba falharam até agora. A concepção e aplicação dos sistemas específicos iniciador / sonda listadas nas obras de Reteno et al. permitiu uma classificação preliminar mais precisa dos vírus recentemente isolados através de amplificação e sequenciamento dos genes virais.- ExADN trato a partir das amostras de cultura positiva usando um sistema de extracção automática de acordo com o protocolo do fabricante.
- Realizar-PCR em tempo real utilizando um termociclador, tal como descrito em Reteno et al. 19
- Sequência usando os mesmos iniciadores que foram usados para a amplificação. Use os iniciadores de segmentação subunidade da polimerase de ARN dirigida por ADN 1 gene: Fstv_S2F 5'-CCA GGA CAT GAT GGT CAC ATA G-3 '(para a frente) e Fstv_S2R 5'-TTG CAC CTC CGC AGT TAA A-3' (reverso) com a sonda Fstv_S2P FAM-TATGCTCCAATGGCCTTCAACGACA-TAMRA.
4. Virus produção, purificação e Genome Sequencing
- Subcultura da cultura ameba único vírus para clonagem de diluição de ponto final.
- Para a produção de: preparar 20 frascos contendo 30 ml de PYG, 10 ml de vermiformis Vermamoeba e 5 ml de vírus isolado a partir de poços já transferido para frascos pequenos.
- Incubar a 30 ° C até estar completalise da amiba. Observar todos os dias por microscopia óptica invertida até que todos os ameba são lisadas.
- Após a lise completa, reunir todos os frascos para um destinatário. Filtrar com um filtro de 0,45 um para eliminar os detritos.
- Comece a purificação por ultracentrifugação a 89.800 xg durante 75 min. Certifique-se para calibrar o peso dos tubos antes de iniciar centrifugação.
- Após centrifugação, remover o sobrenadante a partir de cada tubo por aspiração e re-suspender o sedimento em PAS com o mesmo volume utilizado para a calibração, antes da repetição da centrifugação.
- Tal como referido acima, remover o sobrenadante e re-suspensão de todas as pastilhas em 1 ml de fosfato salino tamponado (PBS).
- Purifica-se o vírus que é produzido, utilizando 25% de sacarose (27,5 g de sacarose em 100 ml de PBS, filtrado num filtro de 0,22 nm).
- Use 8 ml de sacarose e 2 ml de suspensão viral. Centrifugar a 89.800 xg durante 1 h 15 min. Re-suspender o sedimento em 1 ml de PBS. Armazenar a -80 ° C.
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Representative Results
O sistema estudado neste manuscrito validado a sua prova de conceito, isolando dois novos Faustoviruses. Das 70 amostras testadas, dois episódios de lise foi detectada, em contraste com os controlos negativos fiáveis. O controlo negativo para a lise continha uma população ameba 86%. Em contraste, as amostras positivas (ST1 para Saint Pierre de Meyzoargues), e (LC9 para a amostra de La Ciotat 9) mostraram um declínio dramático no amebas fechado; mais de 60% de amebas foram lisadas com a maior percentagem de detritos. Estes resultados consistentes de a fase de detecção do nosso método são representados na Figura 1. Eosina / azul Azul e coloração DAPI confirmou a presença de vírus fábricas dentro do amebas, mostrado na Figura 2. A microscopia electrónica revelou a aparência típica de Megavirales com uma cápside icosaédrica , 200 nm de tamanho, e fibrilas falta (Figura 3). A PCR específico para vírus gigante, particularly para Faustovirus, confirmou nossas descobertas anteriores. Deve ser verificada por PCR, a fim de eliminar resultados ambíguos ou isolamentos contaminados. Os vírus foram clonados, produzida e purificada para toda a sequenciação do genoma. Os genomas das Faustoviruses recentemente isoladas são submetidos sob a seguinte Bioproject: PRJEB11169. O primo-, sub, e última da cultura não mostrou fungos ou contaminação bacteriana, favorecendo esta multiplicação viral. Vermiformis Vermamoeba tolerada a mistura anti-fúngicos e antibióticos. Isto era evidente no controlo negativo de amebas, onde depois de três dias, a cultura final continha mais de 80% ameba vivo. Vermamoeba também proporcionado um bom hospedeiro celular para o isolamento, a produção de uma carga viral significativa após a lise.
Figura 1: Detecção de lise por citometria de fluxo automatizado A represen dados.t as duas amostras, que colhidos Faustovirus e mostrou ameba lise. Uma população ameba vivo foi utilizado como um controlo negativo. Dois portões foram concebidos na trama FSC-SSC, potencialmente correspondente para as células e detritos. Após a co-cultura final, uma grande população de detritos demonstrou a presença de um potencial infecção nas amostras (ST1 e LC9) (B), em comparação com o controlo negativo que não mostrou alterações substanciais nas populações fechados (A). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Vírus fábricas típicos para alguns vírus gigantes em Eosina / azul coloração Azur e DAPI coloração Controlo negativo mostrando a V.. vermiformis núcleo usando eosina / azul Azur(A), e coloração com DAPI (D) (setas apontam para o núcleo da ameba). Ampliação de 1000X. (B, C): Eosina / coloração Azur azul de 1000X ampliação de V. vermiformis infectados com Faustovirus LC9. As setas apontam para o núcleo da ameba infectados circularizado, fábricas de vírus são marcados com um asterisco. (E, F) a coloração DAPI de 1000X de ampliação de V. vermiformis infectados com Faustovirus LC9. As setas apontam para fábricas de vírus às 8 horas após a infecção (E) e de pós-infecção de 12 h (F). Barra de escala de 10 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Negativo MICR coloraçãoOGRAFIA. coloração negativa da suspensão viral após a detecção de lise, mostrando a Faustovirus recém-detectados com a aparência típica de Megavirales, com um capsídeo icosahedral e um tamanho total de 200 nm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| composição PYG | quantidades |
| peptona proteose | 20 g |
| Extracto de levedura | 2 g |
| MgSO4. 7H 2 O | 0,980 g |
| CaCl2 | 0,059 g |
| citrato de sódio. Dihydrate | 1 g |
| Fe (NH4) 2 (SO 4) 2 x 6 H2O | 0,02 g |
| Glicose | 18 g |
| água destilada por | 1? L |
| Ajustar o pH a 6,8 com HCl ou KOH. | |
| Autoclave 15 min a 121 ° C. | |
| meio de privação | quantidades |
| Extracto de levedura | 2 g |
| Glicose | 18 g |
| Fe (NH4) 2 (SO4) 2. 6 H2O | 0,02 g |
| PAS (detalhado abaixo) | 1? L |
| Filtrada em 0,22 milímetros | |
| Uma solução de PAS | quantidades |
| KH 2 PO 4 | 0,136 g |
| Na 2 HPO 4 | 0,142 g |
| PAS solução B | quantidades |
| MgSO 4 .7H 2 O | 4,0 mg |
| CaCl 2 .2H 2 O | 4,0 mg |
| NaCl | 0,120 g |
| 10 ml de cada solução de A e B, são adicionados em 1 L de água destilada. | |
Tabela 1: Solução receitas.
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Discussion
A possibilidade de que poderia ser Faustovirus o primeiro membro de uma nova família Megavirales perto de VPSA foi primeiro sugerida por Reteno et al., 19, mas algumas diferenças ainda pode ser distinguida. Parece claro se Faustovirus deve se juntar à família Asfarviridae ou se deve, em vez formar uma nova família viral putativo. Este problema vai exigir uma investigação mais aprofundada, em particular, uma caracterização mais abrangente de sua morfologia, gama de hospedeiros, o ciclo de replicação e repertório de genes. Mais genótipos Faustovirus devem ser isolados, a fim de expandir o pan-genoma e para melhor compreender as origens e parentes deste grupo viral ou familiar. A técnica que usamos permitiu continuar isolando novos membros desta potencial nova família. Esta técnica é acoplado com a técnica de co-cultura ligeiramente modificado, que actua como um passo de enriquecimento para uma melhor detecção. O tempo requerido por citometria de fluxo para a aquisição de dados para HuO ndreds de amostras não deve exceder meia hora, o que é uma grande vantagem em comparação com o sistema de co-cultura padrão anterior. 9 A técnica é muito melhor do que o sistema padrão anterior, particularmente em termos de sua maior sensibilidade e quantificação precisa.
Das 70 amostras lançados, foram isoladas outras duas Faustoviruses de esgoto, o que poderia fornecer informações sobre a especificidade do ambiente ou ecossistema deste vírus. Com efeito, a especificidade de Faustovirus para os protistas vermiformis Vermamoeba, 19, bem como a nova classificação de HcDNAV entre o Asfarviridae 23 e o facto de que este vírus infecta muitas estirpes de dinoflagelados Heterocapsa spp mas é incapaz de infectar outros tipos de Fitoplânctones 24 sugere a presença de host-especificidade entre Asfarvirus ou seus parentes próximos.
Estas conclusões implicam a utilização de novos suportes celulares que actuam as máquinas específicas ou não-específicas, que podem abrigar esses tipos de vírus. A nossa técnica pode ser adaptado a outros tipos de protistas em condições diferentes. Nosso método constitui um progresso em termos de técnicas de isolamento e cultura viral. Em resumo, os passos de enriquecimento com a mistura antibacteriana e antifúngica mais adequado é crucial para a eliminação de qualquer contaminação bacteriana ou fúngica possível. Nosso meio de privação foi a melhor solução para manter a ameba nas melhores condições para co-cultura, enquanto o meio PAS utilizado na cultura de rotina parece ser inadequada para Vermamoeba spp, porque encistamento rápido foi observado após 24 horas de incubação. Este foi um grande passo no sentido de condições ótimas de cultura em que as técnicas anteriores tinham até agora falharam. A fim de obter os melhores resultados usando os protocolos de cultura aqui descritas, é recomendado o uso de amebas fresco capaz de fagocitose. A mistura de antibióticos e antifúngicos devem ser não-tóxico para protistas ; Assim, recomenda-se para testar a viabilidade do protozoário utilizado na mistura. Todos os materiais utilizados devem ser esterilizados. O trabalho deve ser realizado em um microbiológica garantiu classe pós II para evitar qualquer contaminação provável. Os tempos de incubação e os três estágios de cultura deve ser respeitada como descrito. O tempo de processamento para detecção de citometria de fluxo pode ser calibrado de acordo com os organismos estudados. Uma pequena mudança na população de aquisição electrónica original pode ser observada, mas isto depende do controlo negativo fiável usado como uma população de referência.
bactérias resistentes a múltiplas que podem ser encontrados em cultura e são agentes patogénicos para amiba pode de alguma forma limitar o nosso método de isolamento viral, em que podem ter crescimento bacteriano mascaramento multiplicação dos vírus. Variando-se a mistura de antibióticos ou mesmo filtração da cultura, a fim de eliminar as bactérias de mais de 200 nm de tamanho deve gerir essa limitação às vezes.
"> Todas estas condições adaptadas oferecer um novo procedimento de isolamento ideal, que apoia a multiplicação viral. Esta técnica apresenta uma vantagem considerável na descoberta de novos vírus, particularmente Megavirales, para compreender melhor a sua diversidade, origens, e potencial de patogenicidade.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LSR FORTESSA cytometer | BD Biosciences | France | 649225B4 |
| TECNAI G2 F20 | FEI | Germany | 5027/11 |
| Optical inverted microscope | leica | France | 72643 |
| DNA extraction | Qiagen EZ1 Advanced XL Extraction Robot | France | L106A0452 |
| PCR Cycler CFX96 | Bio rad | France | 785BR06298 |
| PYG medium, PAS, Starvation medium | In house laboratory production | Marseille URMITE | x |
| Amoeba strain CDC-19 | ATCC | France | 50237 |
| Plates | Cellstar | France | 655180 |
| PCR materials, primers. | eurogentec | France | Primers cited in manuscript |
| glasstic slide 10 with grids | Kova | USA | H899871441F |
| Eosin/blue Azur-Hemacolor stain | Merck milipore | France | 111955,6,57,109468 |
| Vacuum driven filters | Thermo scientific | France | BPV4550 / 20170115 |
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher scientific | France | 10010-023 |
| DAPI stain | Life Technologies | France | D1306 |
| cytospin 4 cytocentrifuge | Thermo Fisher scientific | France | 10522013JT184-31 |
| Single cytology tunnel | Biomedical polymers inc. | France | BMP-cyto-S50 |
| Carbon grids | Euromedex | France | FCF400NI |
| Ammonium molibdate | VWR internationanl | France | 21276185 |
| Flasks | SARSTEDT | Germany | 833911 |
| 0.22 μm filters | Milex millipor | France | SE2M229104 |
| Ultracentrifuge Sorval WX 80 | Thermo scientific | France | 9102448 |
| Rapid-flow filters | Nalgene | France | 450-0020 |
References
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