We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.
T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCRα and TCRβ chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.
Receptor de células T (TCR) repertório de ratinhos e seres humanos tem sido estimado em 1 x 10 8 e 2 x 10 6 TCR únicos respectivamente 1,2. Esta grande diversidade permite que as células T a reconhecer uma vasta gama de epitopos de antigénios derivados de auto-péptidos, bem como a partir de agentes patogénicos apresentados pelo complexo de histocompatibilidade principal (MHC) sobre as células apresentadoras de antígenos (APCs). As diferenças sutis nas interações das TCRs com complexos exclusivos péptido-MHC ditar se uma célula T vai sofrer apoptose, anergia, activação, diferenciação, produção de citocina ou citotoxicidade. No entanto, devido ao grande repertório de TCR, como análise de um TCR específico irá responder a um antigénio particular, exige o uso de sistemas de TCR únicos.
Vários ratinhos transgénicos TCR ter sido gerada, a fim de estudar a função de um único TCR num modelo in vivo 3-9. No entanto, é preciso tomar cuidado para ratinhos transgénicos TcR incluindo oo custo, o período de tempo para gerar um único ratinho transgénico e o assim chamado efeito fundador da inserção do transgene no ADN da linha germinal aleatória 10. Assim, relativamente poucos ratinhos transgénicos TCR ter sido gerado para um dado antigénio e as implicações funcionais de alta e baixa afinidade do TCR para o mesmo epitopo raramente são abordados. Para abordar a necessidade de uma abordagem rápida para a tela e estudar vários TCRs individualmente ou em combinação, ratinhos retrogenic ( "retro" de retrovírus e 'genicas' de transgénica) têm sido utilizadas como uma alternativa para ratinhos transgénicos TcR 11-13.
O motivo de consenso péptido 2A encontrado dentro de vários vírus consistem de uma 2A-Asp-Val / Ile-Glut-X-Asn-Pro-Gly-2B-Pro, em que a clivagem ocorre entre a glicina da 2A e a prolina do 2B de cis actuando atividade hidrolase, resultando em pular do ribossoma durante a tradução 10,14-16. Para um diagrama detalhado mostrando a Cleavage dos vários péptidos 2A (F2A, E2A, T2A e P2A) consulte referências 10 – 12. Desta maneira, 2 cistrões (TCR alfa e beta de TCR) pode ser ligado resultando em tradução estequiométrica num único vector. Utilizando esta abordagem, somos capazes de expressar e comparar diretamente vários TCRs específicas de antígeno in vivo.
No protocolo, detalhamos vários passos críticos para garantir a saúde da medula óssea ideal, eficiência de transdução e reconstituição. Primeiro passo crítico é a geração e manutenção das células produtoras viral GP + E86. Use linhas celulares produtoras passagem precoce e manter a 80% de confluência ou inferior antes de ser utilizado. Ao fazer células produtoras viral GP + E86 frescos, garantir as células 293T são passagem precoce e crescente em cultura durante 24-48 horas. Chapeamento de muitas cé…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi suportado por concessões do NIH (5K22A1119151-01 e 1R56DK104903-01) para MLB, Programa Piloto / Viabilidade do Centro de Pesquisa de Diabetes (P30-DK079638) no BCM, JDRF 1-FAC-2014-243-AN APF, ADA 1-15-JF-07, AAI Carreiras em Imunologia Fellowship para MB, e The Robert e Janice McNair Foundation.
DMEM, high glucose + glutamine | Corning Cellgro | 10-013-CV | Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate |
FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
Trypsin-Versene | Lonza | 17-161F | |
0.45 um syringe filter | Thermo Scientific | 194-2545 | |
polybrene | Sigma | H9268-10G | Sterile Filtered in dH2O |
Ciprofloxacin | VWR | AAJ61970-06 | |
5-fluorouracil (5-FU) | VWR | AAA13456-06 | |
Sodium Pyruvate | Corning Cellgro | 25-000-CI | |
MEM nonessential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-CI | |
HEPES 1M solution | Corning Cellgro | 25-060-CI | |
2-Mercaptoethanol | Gibco by Life Technologies | 21985-023 | |
Pen/Strept | Corning Cellgro | 30-002-CI | |
L-glutamine | Corning Cellgro | 25-005-CI | |
150 mm tissue culture dishes | Greiner Bio-one | 639160 | |
Tisue culture-treated 6-well flat plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
70 um nylon cell strainers | Falcon | 352350 | |
Mouse IL-3 | Invitrogen | PMC0033 | |
Human IL-6 | Invitrogen | PHC0063 | |
Mouse Stem Cell Factor | Invitrogen | PMC2113L | |
10x PBS | Corning Cellgro | 46-D13-CM | |
HANKS Buffer | Corning Cellgro | 21020147 | |
BD 10 mL Syringe | BD | 300912 | |
BD 1 mL Syringe | BD | 309659 | |
27G x 1/2 BD Precision Glide Needle | BD | 305109 | |
30G x 1/2 BD Precision Glide Needle | BD | 305106 |