Transdução retroviral de Células de Medula Óssea progenitoras para gerar células T Receptor Retrogenic Mice
Summary
We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.
Abstract
T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCRα and TCRβ chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.
Introduction
Receptor de células T (TCR) repertório de ratinhos e seres humanos tem sido estimado em 1 x 10 8 e 2 x 10 6 TCR únicos respectivamente 1,2. Esta grande diversidade permite que as células T a reconhecer uma vasta gama de epitopos de antigénios derivados de auto-péptidos, bem como a partir de agentes patogénicos apresentados pelo complexo de histocompatibilidade principal (MHC) sobre as células apresentadoras de antígenos (APCs). As diferenças sutis nas interações das TCRs com complexos exclusivos péptido-MHC ditar se uma célula T vai sofrer apoptose, anergia, activação, diferenciação, produção de citocina ou citotoxicidade. No entanto, devido ao grande repertório de TCR, como análise de um TCR específico irá responder a um antigénio particular, exige o uso de sistemas de TCR únicos.
Vários ratinhos transgénicos TCR ter sido gerada, a fim de estudar a função de um único TCR num modelo in vivo 3-9. No entanto, é preciso tomar cuidado para ratinhos transgénicos TcR incluindo oo custo, o período de tempo para gerar um único ratinho transgénico e o assim chamado efeito fundador da inserção do transgene no ADN da linha germinal aleatória 10. Assim, relativamente poucos ratinhos transgénicos TCR ter sido gerado para um dado antigénio e as implicações funcionais de alta e baixa afinidade do TCR para o mesmo epitopo raramente são abordados. Para abordar a necessidade de uma abordagem rápida para a tela e estudar vários TCRs individualmente ou em combinação, ratinhos retrogenic ( "retro" de retrovírus e 'genicas' de transgénica) têm sido utilizadas como uma alternativa para ratinhos transgénicos TcR 11-13.
O motivo de consenso péptido 2A encontrado dentro de vários vírus consistem de uma 2A-Asp-Val / Ile-Glut-X-Asn-Pro-Gly-2B-Pro, em que a clivagem ocorre entre a glicina da 2A e a prolina do 2B de cis actuando atividade hidrolase, resultando em pular do ribossoma durante a tradução 10,14-16. Para um diagrama detalhado mostrando a Cleavage dos vários péptidos 2A (F2A, E2A, T2A e P2A) consulte referências 10 – 12. Desta maneira, 2 cistrões (TCR alfa e beta de TCR) pode ser ligado resultando em tradução estequiométrica num único vector. Utilizando esta abordagem, somos capazes de expressar e comparar diretamente vários TCRs específicas de antígeno in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
No protocolo, detalhamos vários passos críticos para garantir a saúde da medula óssea ideal, eficiência de transdução e reconstituição. Primeiro passo crítico é a geração e manutenção das células produtoras viral GP + E86. Use linhas celulares produtoras passagem precoce e manter a 80% de confluência ou inferior antes de ser utilizado. Ao fazer células produtoras viral GP + E86 frescos, garantir as células 293T são passagem precoce e crescente em cultura durante 24-48 horas. Chapeamento de muitas cé…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi suportado por concessões do NIH (5K22A1119151-01 e 1R56DK104903-01) para MLB, Programa Piloto / Viabilidade do Centro de Pesquisa de Diabetes (P30-DK079638) no BCM, JDRF 1-FAC-2014-243-AN APF, ADA 1-15-JF-07, AAI Carreiras em Imunologia Fellowship para MB, e The Robert e Janice McNair Foundation.
Materials
| DMEM, high glucose + glutamine | Corning Cellgro | 10-013-CV | Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| Trypsin-Versene | Lonza | 17-161F | |
| 0.45 um syringe filter | Thermo Scientific | 194-2545 | |
| polybrene | Sigma | H9268-10G | Sterile Filtered in dH2O |
| Ciprofloxacin | VWR | AAJ61970-06 | |
| 5-fluorouracil (5-FU) | VWR | AAA13456-06 | |
| Sodium Pyruvate | Corning Cellgro | 25-000-CI | |
| MEM nonessential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-CI | |
| HEPES 1M solution | Corning Cellgro | 25-060-CI | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco by Life Technologies | 21985-023 | |
| Pen/Strept | Corning Cellgro | 30-002-CI | |
| L-glutamine | Corning Cellgro | 25-005-CI | |
| 150 mm tissue culture dishes | Greiner Bio-one | 639160 | |
| Tisue culture-treated 6-well flat plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 70 um nylon cell strainers | Falcon | 352350 | |
| Mouse IL-3 | Invitrogen | PMC0033 | |
| Human IL-6 | Invitrogen | PHC0063 | |
| Mouse Stem Cell Factor | Invitrogen | PMC2113L | |
| 10x PBS | Corning Cellgro | 46-D13-CM | |
| HANKS Buffer | Corning Cellgro | 21020147 | |
| BD 10 mL Syringe | BD | 300912 | |
| BD 1 mL Syringe | BD | 309659 | |
| 27G x 1/2 BD Precision Glide Needle | BD | 305109 | |
| 30G x 1/2 BD Precision Glide Needle | BD | 305106 |
References
- Qi, Q., et al. Diversity and clonal selection in the human T-cell repertoire. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13139-13144 (2014).
- Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D., Schoettle, L. N., Blattman, J. N., Antia, R. Estimating the diversity, completeness, and cross-reactivity of the T cell repertoire. Frontiers in immunology. 4, 485 (2013).
- Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature. 333, 742-746 (1988).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Verdaguer, J., et al. Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice. J Exp Med. 186, 1663-1676 (1997).
- Katz, J. D., Wang, B., Haskins, K., Benoist, C., Mathis, D. Following a diabetogenic T cell from genesis through pathogenesis. Cell. 74, 1089-1100 (1993).
- Pauza, M. E., et al. T-cell receptor transgenic response to an endogenous polymorphic autoantigen determines susceptibility to diabetes. Diabetes. 53, 978-988 (2004).
- Jasinski, J. M., et al. Transgenic insulin (B:9-23) T-cell receptor mice develop autoimmune diabetes dependent upon RAG genotype, H-2g7 homozygosity, and insulin 2 gene knockout. Diabetes. 55, 1978-1984 (2006).
- Kersh, G. J., et al. TCR transgenic mice in which usage of transgenic alpha- and beta-chains is highly dependent on the level of selecting ligand. Journal of immunology. 161, 585-593 (1998).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Vignali, D. A. TCR retrogenic mice: A rapid, flexible alternative to TCR transgenic mice. Immunology. 136 (3), 265-272 (2012).
- Holst, J., et al. Generation of T-cell receptor retrogenic mice. Nat Protoc. 1, 406-417 (2006).
- Holst, J., Vignali, K. M., Burton, A. R., Vignali, D. A. Rapid analysis of T-cell selection in vivo using T cell-receptor retrogenic mice. Nat Methods. 3, 191-197 (2006).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Nakayama, M., Guy, C. S., Vignali, D. A. Generation of T cell receptor-retrogenic mice: improved retroviral-mediated stem cell gene transfer. Nat Protoc. 8, 1837-1840 (2013).
- Donnelly, M. L., et al. Analysis of the aphthovirus 2A/2B polyprotein ‘cleavage’ mechanism indicates not a proteolytic reaction, but a novel translational effect: a putative ribosomal ‘skip’. J Gen Virol. 82, 1013-1025 (2001).
- Atkins, J. F., et al. A case for “StopGo”: reprogramming translation to augment codon meaning of GGN by promoting unconventional termination (Stop) after addition of glycine and then allowing continued translation (Go). RNA. 13, 803-810 (2007).
- Doronina, V. A., et al. Site-specific release of nascent chains from ribosomes at a sense codon. Mol Cell Biol. 28, 4227-4239 (2008).
- Bettini, M., et al. TCR affinity and tolerance mechanisms converge to shape T cell diabetogenic potential. Journal of immunology. 193, 571-579 (2014).
- Brehm, M. A., Wiles, M. V., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Generation of improved humanized mouse models for human infectious diseases. J Immunol Methods. 410, 3-17 (2014).
- Brehm, M. A., Shultz, L. D., Greiner, D. L. Humanized mouse models to study human diseases. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 17, 120-125 (2010).
- Chaplin, P. J., et al. Production of interleukin-12 as a self-processing 2A polypeptide. J Interferon Cytokine Res. 19, 235-241 (1999).
- Collison, L. W., et al. The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function. Nature. 450, 566-569 (2007).
- Holst, J., et al. Scalable signaling mediated by T cell antigen receptor-CD3 ITAMs ensures effective negative selection and prevents autoimmunity. Nature immunology. 9, 658-666 (2008).
- Kalos, M., et al. T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia. Sci Transl Med. 3, 95ra73 (2011).
- VanSeggelen, H., et al. T Cells Engineered With Chimeric Antigen Receptors Targeting NKG2D Ligands Display Lethal Toxicity in Mice. Mol Ther. 23, 1600-1610 (2015).
