RNA bağlama proteinlerinin tespiti ile<em> İn Vitro</emAdiposit Kültür> RNA pull-down
Summary
Bir RNA açılan protokolü RNA bağlayıcı proteinlere (RBPS) ve kodlama yapmayan ve kodlama RNA arasındaki etkileşimin saptanması için optimize edilmiştir. androjen reseptörü (AR) için bir RNA fragmanı primer kahverengi adipositlerin lystate onun RBP almak için nasıl kullanılacağını göstermek için bir örnek olarak kullanılmıştır.
Abstract
RNA bağlayıcı proteinler (RBPS) adipoz gelişiminde ve fonksiyonunda bir düzenleyici bir tabaka olarak ortaya çıkmaktadır. RBPS, hedef mRNA stabilitesi ve dönüşüm etkinliğini etkileyerek transkripsiyon sonrası seviyelerde gen ifadesinin düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır. RNA açılan tekniği yaygın mekanizmasının RBPS 'hem de uzun kodlayıcı olmayan RNA'lar' (lncRNAs) işlevini yatan aydınlatmak için gerekli olan RNA-protein etkileşimlerini incelemek için kullanılmıştır. Ancak, adipositlerde yüksek lipid bolluk bu deneyi yapan bir teknik sorun teşkil etmektedir. İşte detaylı RNA açılan protokol birincil adiposit kültürü için optimize edilmiştir. androjen reseptörün (AR) 3 'çevrilmemiş bölge adiposit lystate gelen, onun RBP ortağı Hür proteini almak nasıl göstermek için bir örnek olarak kullanılan bir adenilat-üridilat zengin elementwas içeren (3'UTR) bir RNA fragmanı. Burada tarif edilen yöntem ile etkileşimini tespit etmek için uygulanabilirRBPS ve kodlayıcı olmayan RNA'lar, hem de arasındaki RBPS ve kodlama RNA.
Introduction
RBPS hücrelerde, tek veya çift sarmallı RNA bağlanan ve RNA-protein komplekslerinin oluşturulması katılmak proteinlerdir. RBPS mRNA ve uzun kodlamayan RNA'lar (lncRNAs) de dahil olmak üzere RNA türlerinin, çeşitli bağlamak, ve post-transkripsiyonel seviyede nüfuzlarını olabilir. Hem RBPS ve lncRNAs adipoz geliştirme gibi yeni regülatörleri ortaya çıkan ve 1,2,3 işlev görmektedir. özel bir RNA molekülü ve bir ya da daha RBPS arasındaki etkileşimi saptamak için çoğu zaman gerekli olan, RBP- mekanizmasını ve hücresel yolların lncRNA-aracılı düzenlenmesinin anlamak için, ve bazen de bir RNA protein ortakları tam spektrum tespit etmek transkript. Ancak, deneme nedeniyle adipositlerdeki lipidlerin içeriği yüksek zor olabilir. Burada tarif edilen RNA açılan protokolü primer kültürlerinde 4,5 arasında adiposit lisatlanndan özel bir RNA protein ortakları almak için de kullanılabilir.
Bu proto Gerekçesişöyle col özetlenmiştir. Bir RNA yem, bir DNA şablonu in vivo transkribe olan, biyotin-etiketli streptavidin kaplı manyetik boncuklar 4 ve konjuge. RNA, yem, daha sonra, bir manyetik stand aşağı çekilir RNA-protein kompleksleri oluşumuna olanak sağlamak için hücresel lizatları ile inkübe edilir. Daha spesifik olarak, RNA açılan protokolü aşağıda açıklanan HÜR proteini, birincil kültür theadipocytelysate gelen mRNA 6,7 3'UTR'sinden bağlı bir evrensel ifade RBP almak için yem olarak AR 3'UTR'sinden bir RNA parçası kullanın. Bu deneyde bağlanma spesifitesini test etmek için, uygun olmayan bir RNAas da boş streptavidin boncuk kontrol olarak dahil edilir. Bu protokol belirli RBP yakalama teyit etmek veya çekilen RBPS sırasıyla 8 tam repertuarını tespit etmek western blotting ya da kütle spektrofotometresi (MS) ile uyumludur.
Çeşitli teknikler RNA-protein etkileşimi incelemek için kullanılabilirs. Belirli bir RBP, RIP (RNA immünopresipitasyon) ve CLIP (UV çapraz ve immünopresipitasyon) bağlı RNA'lar ortaya çıkarmak için uygulanabilir. Buna karşılık, belirli bir RNA protein ortakları belirlemek için, RNA açılır, cıvıltı (RNA saflaştırma ile kromatin izolasyon), ABC (RNA hedeflerinin yakalanması hibridizasyon analizi) ve RAP (RNA antisens arıtma) uygulanabilir. Daha sonra olanlar ile karşılaştırıldığında, RNA açılan teknik kurmak için daha az çaba gerektirir. In vitro ve in vivo proteinler yakalamak için kullanılabilir. Onun in vitro meslektaşı daha teknik olarak daha zor RNA pull, in vivo yaklaşım hücrelerinde çapraz bağlama RNA-protein etkileşimleri korur, hücrelerin ilgi aptamer-etiketli RNA'lar yakalar ve daha sonra bağlı RBPS algılar. RNA açılan düşük bol RBPS ettirecek ve izole edilmesi ve hücresel düzenleme 9,10 kontrol farklı fonksiyonel rolleri var RNA-protein kompleksleri tespit etmek için kullanılabilir </s> Yukarı.
Protocol
Representative Results
Discussion
lncRNAs ve RBPS ancak bu moleküllerin moleküler mekanizmalar tam olarak anlaşılmamıştır, hastalık ve sağlıkta önemli roller üstlenir. lncRNA molekülleri ile etkileşime proteinlerin tanımlanması düzenleyici mekanizmaların tanıtılması yolunda önemli bir adımdır. RNA açılan deney sistemi ile RBPS zenginleştirilmesi, bir hücre lizatından proteinler seçici streptavidin manyetik taneleri bağlanmış biyo-küçültülmüş RNA yemler kullanılarak elde edilebilir, böylece kompleks etkileşim iç…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Singapur NRF bursu (NRF-2011NRF-NRFF001-025) yanı sıra CBRG (NMRC / CBRG / 0070/2014) tarafından finanse edildi.
Materials
| Major materials used in this study. | |||
| MEGAscript kit | Ambion | ||
| Biotin-14-CTP | Invitrogen | ||
| NucAway spin columns | Ambion | ||
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | ||
| HuR (3A2) mouse monoclonal antibody (sc-5261) | Santa Cruz Biotechnology | ||
| Goat anti-mouse IgG-HRP(sc-2005) | Santa Cruz Biotechnology | ||
| Hypure Molecular Biology Grade Water (nuclease-free) | HyClone | ||
| Phosphate Buffer Saline (1×PBS) | HyClone | ||
| RNase inhibitor | Bioline | ||
| Protease inhibitor | Sigma | ||
| Pfu Turbo DNA polymerase | Agilent Technologies | ||
| TRIsure | Bioline | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Major equipment used in this study. | |||
| Sorvall Legend Micro 21R centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Sorvall Legend X1R centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Bio-Rad T100 thermal cycler | Bio-Rad | ||
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| BOECO rotator Multi Bio RS-24 | BOECO,Germany | ||
| Protein gel electrophoresis and blotting apparatus | Bio-Rad | ||
| DynaMag-2 magnet | Life Technologies |
References
- Huot, M. &. #. 2. 0. 1. ;., et al. The Sam68 STAR RNA-binding protein regulates mTOR alternative splicing during adipogenesis. Mol Cell. 46 (2), 187-199 (2012).
- Sun, L., et al. Long noncoding RNAs regulate adipogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3387-3392 (2013).
- Engreitz, J. M., et al. The Xist lncRNA exploits three-dimensional genome architecture to spread across the X-chromosome. Science. 341 (6147), 1237973 (2013).
- Zhao, X. Y., Li, S., Wang, G. X., Yu, Q., Lin, J. D. A long noncoding RNA transcriptional regulatory circuit drives thermogenic adipocyte differentiation. Mol Cell. 55, 372-382 (2014).
- Alvarez-Dominguez, J. R., et al. De novo reconstruction of adipose tissue transcriptomes reveals long non-coding RNA regulators of brown adipocyte development. Cell Metab. 21, 764-776 (2015).
- Adams, D. J., Beveridge, D. J., van der Weyden, L., Mangs, H., Leedman, P. J., Morris, B. J. HADHB, HuR, and CP1 bind to the distal 3-untranslated region of human renin mRNA and differentially modulate renin expression. J Biol Chem. 278 (45), 44894-44903 (2003).
- Yeap, B. B., et al. Novel binding of HuR and poly(C)-binding protein to a conserved UC-rich motif within the 3´ untranslated region of the androgen receptor messenger RNA. J Biol Chem. 277, 27183-27192 (2002).
- König, J., Zarnack, K., Luscombe, N. M., Ule, J. Protein-RNA interactions: new genomic technologies and perspectives. Nat Rev Genet. 13, 77-83 (2012).
- Ferrè, F., Colantoni, A., Helmer-Citterich, M. Revealing protein-lncRNA interaction. Briefings in Bioinformatics. , 1-11 (2015).
- McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biol. 15 (1), 203 (2014).
- Lee, Y. S., et al. AU-rich element-binding protein negatively regulates CCAAT enhancer binding protein mRNA stability during long term synaptic plasticity in Aplysia. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15520-15525 (2012).
- Hermann, M., Cermak, T., Voytas, D. F., Pelczar, P. Mouse genome engineering using designer nucleases. J Vis Exp. (86), (2014).
- Tsai, M. C., et al. Long Noncoding RNA as Modular Scaffold of Histone Modification Complexes. Science. 329 (5992), 689-693 (2010).
- Wan, Y., et al. Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome. Nature. 505, 706-709 (2014).
- Li, H., et al. Identification of mRNA binding proteins that regulate the stability of LDL receptor mRNA through AU rich elements. J Lipid Res. 50 (5), 820-831 (2009).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
- Chu, C., et al. Systematic Discovery of Xist RNA Binding Proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
- Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs. Nat Struct Mol Biol. 22 (1), 29-35 (2015).
- Zhao, J., et al. Genome-wide identification of Polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).
