Mess Granulozyten und Monozyten Phagozytose und oxidativer Burst-Aktivität im menschlichen Blut
Summary
The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.
Abstract
The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots (“H” and “F”) of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.
Introduction
Die Granulozyten und Monozyten Phagozytose / oxidativen Burst (OB) Aktivitätstest ist eine einfache, geradlinige Technik , die häufig verwendet wird , um Informationen über angeborene Immunfunktion nach längerer und intensiver Bewegung zu sammeln. 1-4 Wenn die Antwort des Immunsystems studieren ein Stimulus sind Granulozyten und Monozyten von besonderem Interesse , weil sie eine zentrale Rolle in der Wirtsabwehr und sind die ersten Immunzellen an den Ort der Infektion zu akkumulieren spielen. 5 Neutrophile, eine Art von Granulozyten, sind die ersten Zellen in beschädigten Muskel zu translozieren Gewebe nach intensiver Übung. 6 Phagozytose und OB – Aktivität sind die häufigsten Maßnahmen von Granulozyten und Monozyten – Funktion, 7 und werden als Indikatoren der angeborenen Immunzellfunktion aufgrund ihrer zentralen Rolle in sowohl der Infektion und dem Reparaturprozess bevorzugt.
Der Test in diesem Manuskript utili beschriebenzes eine Grund Durchflusszytometer eine quantitative Bestimmung von Granulozyten und Monozyten Phagozytose und OB-Aktivität in Vollblut zur Verfügung zu stellen. Die Verwendung von Vollblut in dieser Technik ist vorteilhaft, da es die Assay erlaubt ohne zeitraubende Reinigungsverfahren durchgeführt werden. Dieser Test kann leicht eine Vielzahl von Forschungsdesigns und Labor-Fähigkeiten zur Aufnahme geändert werden. B. Liao et al. Verwendeten eine ähnliche Technik , die Neutrophilen – OB – Aktivität zu zeigen , erhöht wird und neutrophile Phagozytose wird nach einer traumatischen Hirnverletzung verringert. 8 In einem anderen Beispiel, McFarlin et al. Beschrieben eine elegante Abwandlung dieser Technik , die Allophycocyanin verwendet (APC ) -konjugierte CD66b und High-Performance – Tandem – APC-konjugierten CD45 – Markierung mit bildbasierten Durchflusszytometrie Granulozyten hinsichtlich ihrer Phagozytose und OB – Aktivitäten zu klassifizieren. 7,9
Unsere Forschungsgruppe hat verschiedene Anpassungen dieser te verwendetchnique als Indikator für die angeborene Immunfunktion bei Übergewicht, fettleibig, und athletische Bevölkerung seit fast 20 Jahren. 10,11 Der Text wird den Leser bieten mit Schritt- für -Schritt – Anleitungen zur Durchführung dieses Tests und Bereiche hervorheben , dass der Leser anpassen kann die Bedürfnisse ihrer Forschung gerecht zu werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Handschrift stellt eine Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Bestimmung von zwei Indikatoren von Granulocyten und Monocyten-Funktion. Wir haben einige Schritte identifiziert, die für den Erfolg dieses Tests sind entscheidend. Ein solcher Schritt ist das Eisbad Inkubation, die Zugabe von Bakterien unmittelbar vor auftritt. Gründliches Kühlen aller Proben wird die Wirkung der Temperatur auf die Phagozytose und OB-Aktivität minimieren. Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Zugabe von Bakterien zu jeder Probe….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten sich Zack Shue, Casey John und Lynn Cialdella-Kam für ihre Unterstützung bei der Optimierung dieses Verfahrens zu bestätigen.
Materials
| 12 x 75 mm tubes, with cap | VWR | 20170-579 | You will need 2 tubes per sample ("H" and "F") plus 3 tubes per batch (for assay controls; "F", "H", and "Blood only"). |
| PBS (10X), pH 7.4 | Life Technologies | 70011-044 | |
| Bottle top 0.2 µm cellulose acetate filter (500 ml capacity) | Fisher Scientific | 09-741-07 | |
| Glucose, powder | Life Technologies | 15023-021 | |
| Citric acid (anhydrous, cell culture tested, plant cell culture tested) | Sigma-Aldrich | C2404-100G | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma-Aldrich | S4641-25G | |
| Dihydroethidium (Hydroethidine) (HE) | Life Technologies | D11347 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) Anhydrous | Life Technologies | D12345 | |
| Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, fluorescein conjugate (FITC) | Life Technologies | S2851 | |
| Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, unlabeled | Life Technologies | S-2859 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| 4.0 mL vacutainer containing 7.2 mg K2EDTA, spray-dried | VWR | BD367861 | You will need 1 K2 EDTA blood collection tube per sample. |
| 4.0 mL vacutainer containing 68 USP units Lithium Heparin, spray-coated | VWR | BD367884 | You will need 1 Lithium Heparin blood collection tube per sample. |
| COULTER Ac·T 5diff CP | Beckman Coulter | 6605705 | i.e., hematology analyzer |
| COULTER Ac·T 5diff Rinse | Beckman Coulter | 8547167 | |
| COULTER Ac·T 5diff Fix | Beckman Coulter | 8547171 | |
| COULTER Ac·T 5diff WBC Lyse | Beckman Coulter | 8547170 | |
| COULTER Ac·T 5diff Hgb Lyse | Beckman Coulter | 8547168 | |
| COULTER Ac·T 5diff Cal Calibrator | Beckman Coulter | 7547175 | |
| COULTER Ac·T 5diff Control Plus | Beckman Coulter | 7547198 | |
| AcT 5diff Diluent | Beckman Coulter | 8547169 | |
| 200 µL extended-length pipette tips | VWR | 37001-526 | |
| Insulated ice pan | VWR | 89198-980 | For ice water bath. |
| Open metal tube rack | VWR | 60916-702 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140-111 | |
| TQ-Prep Workstation | Beckman Coulter | 6605429 | i.e., automated cell lyse preparation workstation |
| ImmunoPrep Reagent System | Beckman Coulter | 7546999 | i.e., RBC lyse/WBC fix reagent system |
| Cytomics FC500 MCL Flow Cytometry System with CXP Software | Beckman Coulter | 626553 | |
| IsoFlow Sheath Fluid | Beckman Coulter | 8547008 | |
| COULTER CLENZ | Beckman Coulter | 8546929 | |
| Flow-Check Fluorospheres | Beckman Coulter | 6605359 | i.e., alignment and fluidics verification fluorospheres |
| FlowJo Software | FlowJo | FlowJo | i.e., flow cytometry analysis software |
| Excel Software | Microsoft | Microsoft Excel | i.e., electronic spreadsheet program |
References
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