Summary

La reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón con factores de transcripción para inducir un programa Hemogenic

Published: December 16, 2016
doi:

Summary

The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.

Abstract

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis “in a dish,” allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.

Introduction

La hematopoyesis es un proceso de desarrollo complejo en el que las células madre hematopoyéticas (HSC) brote fuera endotelio hemogenic presente en una variedad de sitios hematopoyéticas embrionarias tales como la aorta-gónada-Mesonefros y la placenta 1,2. La incapacidad de la cultura HSCs in vitro impide el análisis en profundidad de este proceso, así como la aplicación clínica de estos estudios. Para evitar esta limitación, los estudios anteriores han intentado derivar HSCs de novo ya sea a través de la diferenciación de células pluripotentes madre (PSC) 3, o plasticidad inducida en las células somáticas y diferenciación dirigida usando medios de reprogramación 4,5. Estos estudios, sin embargo, no generan células engraftable clínicamente seguras o permiten el estudio de la hematopoyesis definitiva del desarrollo "en un plato."

La novela de trabajo establecido por Yamanaka y sus colegas para generar células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) a partir de fibroblastos somática provides un marco para el factor de transcripción (TF) las estrategias basadas en la sobreexpresión de la reprogramación de células suerte 6,7. Este trabajo ha llevado a los investigadores en varios campos para generar tipos de células de elección a través de la reprogramación de las células somáticas TF fácilmente obtenibles. El objetivo de la estrategia de reprogramación se describe aquí es inducir un proceso hemogenic a partir de células somáticas de ratón utilizando un enfoque reprogramación basado TF con el objetivo de trasladar estas conclusiones al sistema humano para reprogramar fibroblastos específicos del paciente con el fin de estudiar la hematopoyesis humana in vitro y generar productos sanguíneos específicos del paciente para el modelado de la enfermedad, las pruebas de drogas, y el trasplante de células madre.

El primer paso para asegurar la reprogramación adecuada en este sistema de ratón fue desarrollar una línea reportero que sirvió como una lectura para la expresión de CD34, un marcador conocido en las células progenitoras endoteliales y células madre hematopoyéticas. Para ello, las líneas de ratones transgénicos huCD34-TTA y teto-H2BGFP se utilizaron para gfibroblastos enerate dobles de ratón transgénico embrionarias (MEFs), ahora denotados 34 / H2BGFP, que presentan fluorescencia verde después de la activación del promotor de CD34 8. Esto permitió la detección de una variedad de TFS sabe que son necesarios en diferentes puntos durante la especificación y el desarrollo hematopoyético. Comenzando con 18 TFS en pMX vectores retrovial (determinados a través de la literatura minera y el perfilado de la etiqueta GFP retener las HSC de la anteriormente descrita 34 ratones / H2BGFP), 34 / H2BGFP MEFs fueron transducidas con todos los factores y se cultivan en AFT024 HSC-apoyar las células del estroma. Después de la detección de 34 activación / H2BGFP, TFS se retiraron posteriormente de la reprogramación cóctel hasta que se identificó el conjunto óptimo de TFS para la activación de reportero. Después de esta pantalla inicial, los factores se transfirieron a un sistema de vector inducible pFUW DOX para permitir la expresión controlable de la TFS. Dado que estos dos sistemas controlables DOX son incompatibles (las 34 células / H2BGFP y los vectores inducibles pFUW), MEFs deSe requiere C57BL / 6 ratones de tipo salvaje. También era necesario para proporcionar un microambiente apropiado para permitir hemogenesis proceder y crear progenitores clonogénicos multilinaje.

Los estudios actuales que tratan de reprogramar células somáticas en células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPCs) se han reunido variados niveles de éxito 9-11. Hasta la fecha, la generación de ratón y humanos con HSPCs trasplantables a largo plazo y la capacidad de repoblación de auto-renovación no se ha conseguido utilizando el mismo conjunto de TFS. En este protocolo, se realiza una descripción detallada de la estrategia previamente establecida para inducir de forma reproducible hemogenesis en MEFs. Se demuestra que la introducción de un conjunto mínimo de TFS (GATA2, Gfi1b, directores financieros, y ETV6) es capaz de instigar un programa complejo de desarrollo in vitro que proporciona una plataforma en la que la hematopoyesis en el desarrollo y aplicación clínica de reprogramación hematopoyéticas pueden ser estudiados más a fondo 12.

Protocol

declaración de la ética: líneas celulares de ratón se derivan siguiendo las pautas de cuidado de animales de la Escuela de Medicina de Icahn en el Monte Sinaí, y debe hacerse de acuerdo con cualquier institución de destino. 1. fibroblastos de embriones de ratón (MEF) Aislamiento de C57BL / 6 ratones Configurar el apareamiento cronometrado 13. Una vez que se visualiza un tapón vaginal, considere este Día 0,5. Se separan las hembras enchufados en la fecha enchufe y comproba…

Representative Results

La hematopoyesis es un proceso complejo del desarrollo que se inicia en varios sitios embrionarias. Células endoteliales Hemogenic residen en estos sitios y dan lugar a través de las CMH de células en ciernes 23. Este proceso actualmente no puede ser reproducido mediante la colocación de HSCs o precursores hematopoyéticos en cultivo, lo que exige una metodología para obtener de alguna manera estas células in vitro, ya sea por HSPC expansión ex vivo o …

Discussion

Generación de HSPCs de novo a partir de células somáticas fácilmente alcanzables ofrece un método único para estudiar la hematopoyesis in vitro, y la oportunidad de aplicar esta tecnología potencialmente para el sistema humano. Esta traducción generaría una nueva herramienta para estudiar la enfermedad hematológica humano en un plato, así como proporcionar las plataformas de pruebas de drogas y la orientación de genes oportunidades para tratar numerosos trastornos con nuevas terapias o tran…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by an NHLBI grant to K.M. and I.R.L. (1RO1HL119404). Carlos-Filipe Pereira was the recipient of a Revson Senior Biomedical Fellowship. We gratefully acknowledge the Mount Sinai hESC/iPSC Shared Resource Facility and S. D’Souza for assistance with materials and protocols. We also thank the Mount Sinai Flow Cytometry, Genomics, and Mouse facilities.

Materials

DMEM Invitrogen 11965-092
0.45uM filters Corning 430625
Amicon Ultra centrifugal filters Millipore UFC900324
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
L-Glutamine Invitrogen 25030-081
FBS Gemini's Benchmark 100-106
PBS Life Technologies 14190-144
18G needles BD 305195
20G needles BD 305175
25G needles BD 305125
Collagenase Type I Sigma C0130-100MG
TrypLE Express Invitrogen 12605-010
Myelocult media Stem Cell Technologies M5300
SCF R & D Systems 455-MC
Flt3L R & D Systems 427-FL
IL-3 R & D Systems 403-ML
IL-6 R & D Systems 406-ML
TPO R & D Systems 488-TO
Doxycycline Sigma D9891-1G
Polybrene (hexadimethrine bromide) Sigma AL-118
Durapore 0.65uM membrane filters Millipore DVPP14250
Methylcellulose media Stem Cell Technologies Methocult M3434
Hydrocortisone Stem Cell Technologies 07904
C57BL/6 mice The Jackson Laboratory 000664
Gelatin Sigma G-1890 100g
pFUW-tetO Addgene Plasmid #20321
Gata2 Origene MR226728
Gfi1b Origene MR204861
cFos  Addgene Plasmid #19259
Etv6 Origene MR207053
psPAX2 Addgene Plasmid #12260
pMD2.G Addgene Plasmid #12259
CaCl2 Sigma C5670-100g
FUW-M2rtTA Addgene Plasmid #20342
35 x 10 mm culture dishes Thermo Scientific 171099

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Daniel, M. G., Pereira, C., Bernitz, J. M., Lemischka, I. R., Moore, K. Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program. J. Vis. Exp. (118), e54372, doi:10.3791/54372 (2016).

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