Modelo In Vivo para Pruebas Efecto de la hipoxia sobre la metástasis tumoral
Summary
This manuscript describes the development of an animal model that allows for the direct testing of the effects of tumor hypoxia on metastasis and the deciphering the mechanisms of its action. Although the experiments described here focus on Ewing sarcoma, a similar approach can be applied to other tumor types.
Abstract
Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic effect is lacking and the exact mechanisms of its action are unclear. Here, we report an animal model that allows for direct testing of the effects of tumor hypoxia on ES dissemination and investigation into the underlying pathways involved. This approach combines two well-established experimental strategies, orthotopic xenografting of ES cells and femoral artery ligation (FAL), which induces hindlimb ischemia. Human ES cells were injected into the gastrocnemius muscles of SCID/beige mice and the primary tumors were allowed to grow to a size of 250 mm3. At this stage either the tumors were excised (control group) or the animals were subjected to FAL to create tumor hypoxia, followed by tumor excision 3 days later. The efficiency of FAL was confirmed by a significant increase in binding of hypoxyprobe-1 in the tumor tissue, severe tumor necrosis and complete inhibition of primary tumor growth. Importantly, despite these direct effects of ischemia, an enhanced dissemination of tumor cells from the hypoxic tumors was observed. This experimental strategy enables comparative analysis of the metastatic properties of primary tumors of the same size, yet significantly different levels of hypoxia. It also provides a new platform to further assess the mechanistic basis for the hypoxia-induced alterations that occur during metastatic tumor progression in vivo. In addition, while this model was established using ES cells, we anticipate that this experimental strategy can be used to test the effect of hypoxia in other sarcomas, as well as tumors orthotopically implanted in sites with a well-defined blood supply route.
Introduction
El sarcoma de Ewing (ES) es una neoplasia agresiva que afecta a niños y adolescentes. 1 Los tumores se desarrollan en los tejidos blandos y huesos, comúnmente en las extremidades. Mientras que la presencia de metástasis es el factor pronóstico adverso más poderosa para los pacientes ES, los mecanismos subyacentes a su desarrollo siguen sin estar claros. 2 Tumor hipoxia es uno de los pocos factores implicados en la progresión de la ES. En pacientes ES, la presencia de áreas no perfundido dentro del tejido tumoral está asociada con mal pronóstico. 3 In vitro, la hipoxia aumenta la invasividad de las células madre embrionarias y desencadena la expresión de genes pro-metastásicos. 4-6 Sin embargo, a pesar de estas líneas de evidencia, no existe una prueba directa para ES hipoxia inducida por la progresión y diseminación. Por otra parte, los mecanismos por los que la hipoxia ejerce tales efectos son, en la actualidad, desconocidos. Por lo tanto, hemos creado un modelo in vivo para llenar la brecha entre los existentes en datos in vitro y obser clínicavaciones. Este sistema modelo permite la prueba directa de los efectos de la hipoxia en tumores que se producen en su entorno natural, el uso de imágenes de resonancia magnética (MRI) para seguir la progresión tumoral y la metástasis in vivo en combinación con ex vivo análisis patológicos y moleculares (Figura 1).
Puesto que ningún modelo transgénico establecida de ES está disponible actualmente, los estudios in vivo en las propiedades metastásicas de estos tumores dependen de inyecciones de células humanas en ratones inmunocomprometidos. Mientras que el uso de animales inmunológicamente con discapacidad puede subestimar el impacto del sistema inmune en la progresión de la enfermedad, la capacidad de utilizar células humanas aumenta traducibilidad de tales estudios. Entre los diferentes modelos de xenoinjertos, inyecciones sistémicas en vena de la cola son los más fáciles de realizar, sin embargo, que omiten los pasos iniciales de intravasación de células tumorales y se escapan del sitio primario de crecimiento. 7-12 Por otro lado, orthoto xenoinjertos pic, que implica la inyección de células tumorales en los huesos (fémur, las costillas o los músculos), es más difícil técnicamente, pero también más biológicamente relevante para el cáncer humano. 13-16 Sin embargo, en el pasado, la alta morbilidad asociada con el rápido crecimiento de los tumores primarios se ha hecho necesario a menudo la eutanasia de los animales antes del desarrollo de metástasis. En este estudio, hemos empleado un modelo previamente establecido de inyecciones de células en el músculo gastrocnemio, seguido de la escisión del tumor primario resultante combinada con la monitorización longitudinal de la progresión metastásica por MRI. 17,18 Tales inyecciones en el músculo gastrocnemio en las proximidades de la tibia permiten el crecimiento del tumor en dos entornos naturales ES – músculos y huesos – y dan lugar a metástasis distantes a lugares típicamente afectadas en los seres humanos. 18 De este modo, este modelo recapitula con precisión los procesos que ocurren en pacientes metastásicos ES durante la progresión de la enfermedad.
tienda "> La localización de los tumores primarios en el miembro posterior inferior también facilita el control preciso del suministro de sangre al tejido tumoral. ligadura de la arteria femoral (FAL) es una técnica bien establecida utilizado en la investigación de la angiogénesis para bloquear el flujo de sangre a las regiones distales de la pierna e investigar la vascularización del tejido en respuesta a la isquemia. 19,20 importante destacar que la caída inicial en el flujo sanguíneo es seguido por la apertura de los vasos colaterales y la reperfusión del tejido observado aproximadamente 3 días después de FAL. 20 por lo tanto, cuando se realiza en un miembro portador de un tumor, este modelo recrea eventos hipoxia / reperfusión que se producen de forma natural en los tumores que crecen rápidamente y permite el escape de las células tumorales metastásicas debido a la restauración de la perfusión de la extremidad posterior inferior a través de los vasos colaterales de reciente apertura. 21 es importante destacar que este procedimiento debe realizarse cuando el tamaño del tumor es lo suficientemente pequeño para evitar la hipoxia excesivo en los tumores de control (típicamente en el portador de un tumor de ternera volUME: 150 – 250 mm 3), asegurando diferencias significativas en los niveles de hipoxia tumoral entre el control y los grupos tratados con el FAL.Además de la monitorización longitudinal de los efectos de la hipoxia en es la latencia y la frecuencia de metástasis, este modelo también permite la recogida de tejidos y el desarrollo de nuevas líneas de células de los tumores primarios y metástasis. Es importante destacar que, el trabajo previo estableció que las líneas celulares metástasis derivados exhiben una mayor potencial metastásico a reintroducción a los animales, lo que indica que la difusión de tumores se asocia con cambios permanentes en el fenotipo de las células tumorales, y la validación de este modo el uso de estas líneas celulares de descifrar los procesos metastásicos. 18 En conjunto, estos modelos se pueden utilizar ahora para los análisis genéticos y moleculares requeridos para la identificación de vías metastásicas hipoxia inducida.
A medida que la hipoxia es un factor pro-metastásico mejora de la malignidad de diversos tumors, nuestro modelo puede ser utilizado como una plataforma para investigar el papel de la hipoxia en otros tipos de tumores que se desarrollan de forma natural en las extremidades, tales como osteosarcoma y rabdomiosarcoma. 21-23 Además, un enfoque similar se puede aplicar a tumores malignos que crecen en otras localizaciones anatómicas con una ruta bien definida de suministro de sangre. En última instancia, el modelo puede ser modificado y su utilidad extiende más lejos, dependiendo de las necesidades individuales de investigación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nuestro modelo implica la comparación de la metástasis en dos grupos experimentales – un grupo de control, donde se permite a los tumores a desarrollar en el miembro posterior seguida de amputación al llegar a un volumen de ternera de 250 mm 3, y un grupo hipoxia expuesto, en el que el tumor- teniendo los miembros posteriores se somete a FAL en el mismo volumen, seguido de la amputación 3 días más tarde. A pesar de que en estos experimentos, los tumores tratados con FAL se amputan con un ligero retraso,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health (NIH) grants: UL1TR000101 (previously UL1RR031975) through the Clinical and Translational Science Awards Program, 1RO1CA123211, 1R03CA178809, R01CA197964 and 1R21CA198698 to JK. MRI was performed in the Georgetown-Lombardi Comprehensive Cancer Center’s Preclinical Imaging Research Laboratory (PIRL) and tissue processing in the Georgetown-Lombardi Comprehensive Cancer Center’s Histopathology & Tissue Shared Resource, both supported by NIH/NCI grant P30-CA051008. The authors thank Dan Chalothorn and James E. Faber, Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, for their assistance with postmortem x-ray angiography, and providing insight and expertise on collaterogenesis.
Materials
| SK-ES1 Human Ewing sarcoma (ES) cells | ATCC | ||
| TC71 Human ES cells | Kindly provided from Dr. Toretsky | ||
| McCoy's 5A (modified) Medium | Gibco by Life Technologies | 12330-031 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500mL | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
| Fungizone® Antimycotic | Gibco by Life Technologies | 15290-018 | |
| MycoZap™ Prophylactic | Lonza | VZA-2032 | |
| Collagen Type I Rat tail high concetration | BD Biosciences | 354249 | |
| SCID/beige mice | Harlan or Charles River | 250 (Charles River) or 18602F (Harlan) | |
| 1 mL Insulin syringes with permanently attached 28G½ needle | BD | 329424 | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride Injection, USP) | Hospira, INC | NDC 0409-7984-37 | |
| Digital calipers | World Precision Instruments, Inc | 501601 | |
| Surgical Tools | Fine Science Tools | ||
| Rimadyl (Carprofen) Injectable | Zoetis | ||
| Hypoxyprobe-1 (Pimonidazole Hydrochloride solid) | HPI, Inc | HP-100mg | |
| hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250mg) | HPI, Inc | CCI-103F-250mg | |
| Povidone-iodine Swabstick | PDI | S41350 | |
| Sterile alcohol prep pad | Fisher HealthCare | 22-363-750 | |
| LubriFresh P.M. (eye lubricant ointment) | Major Pharaceuticals | NDC 0904-5168-38 | |
| VWR Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | |
| Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with size 50 blade | Oster | 078005-050-002 (clipper), 078919-006-005 (blade) | |
| Nair Lotion with baby oil | Church & Dwight Co., Inc. | ||
| Silk 6-0 | Surgical Specialties Corp | 752B | |
| Prolene (polypropylene) suture 6-0 | Ethicon | 8680G | |
| Vicryl (Polyglactin 910) suture 4-0 | Ethicon | J386H | |
| Fisherbrand Applicators (Purified cotton) | Fisher Scientific | 23-400-115 | |
| GelFoam Absorbable Dental Sponges – Size 4 | Pfizer Pharmaceutical | 9039605 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Autoclip remover | BD | 427637 | |
| Aound clip | BD | 427631 | |
| MRI 7 Tesla | Bruker Corporation | ||
| Paravision 5.0 software | Bruker Corporation | ||
| CO2 Euthanasia system | VetEquip | ||
| 25G 5/8 Needle (for heart-puncture) | BD | 305122 | |
| 0.1 mL syringe (for heart-puncture) | Terumo | SS-01T | |
| K3 EDTA Micro tube 1.3ml | Sarstedt | 41.1395.105 | |
| 10% Neutral Buttered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 |
References
- Lessnick, S. L., Ladanyi, M. Molecular pathogenesis of Ewing sarcoma: new therapeutic and transcriptional targets. Annu Rev Pathol. 7, 145-159 (2012).
- Ladenstein, R. Primary disseminated multifocal Ewing sarcoma: results of the Euro-EWING 99 trial. J Clin Oncol. 28, 3284-3291 (2010).
- Dunst, J., Ahrens, S., Paulussen, M., Burdach, S., Jurgens, H. Prognostic impact of tumor perfusion in MR-imaging studies in Ewing tumors. Strahlenther Onkol. 177, 153-159 (2001).
- Aryee, D. N. Hypoxia modulates EWS-FLI1 transcriptional signature and enhances the malignant properties of Ewing’s sarcoma cells in vitro. 癌症研究. 70, 4015-4023 (2010).
- Knowles, H. J., Schaefer, K. L., Dirksen, U., Athanasou, N. A. Hypoxia and hypoglycaemia in Ewing’s sarcoma and osteosarcoma: regulation and phenotypic effects of Hypoxia-Inducible Factor. BMC cancer. 10, 372 (2010).
- Tilan, J. U. Hypoxia shifts activity of neuropeptide Y in Ewing sarcoma from growth-inhibitory to growth-promoting effects. Oncotarget. 4, 2487-2501 (2013).
- Franzius, C. Successful high-resolution animal positron emission tomography of human Ewing tumours and their metastases in a murine xenograft model. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 33, 1432-1441 (2006).
- Hauer, K. DKK2 mediates osteolysis, invasiveness, and metastatic spread in Ewing sarcoma. 癌症研究. 73, 967-977 (2012).
- Manara, M. C. Preclinical in vivo study of new insulin-like growth factor-I receptor–specific inhibitor in Ewing’s sarcoma. Clin Cancer Res. 13, 1322-1330 (2007).
- Scotlandi, K. Murine model for skeletal metastases of Ewing’s sarcoma. J Orthop Res. 18, 959-966 (2000).
- Vormoor, J. Establishment of an in vivo model for pediatric Ewing tumors by transplantation into NOD/scid mice. Pediatr Res. 49, 332-341 (2001).
- Picarda, G. Preclinical evidence that use of TRAIL in Ewing’s sarcoma and osteosarcoma therapy inhibits tumor growth, prevents osteolysis, and increases animal survival. Clin Cancer Res. 16, 2363-2374 (2010).
- Vormoor, B. Development of a preclinical orthotopic xenograft model of ewing sarcoma and other human malignant bone disease using advanced in vivo imaging. PLoS One. 9, e85128 (2014).
- Wang, Y. Platelet-derived growth factor receptor beta inhibition increases tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) sensitivity: imatinib and TRAIL dual therapy. Cancer. 116, 3892-3902 (2010).
- Wang, Y. X. Inhibiting platelet-derived growth factor beta reduces Ewing’s sarcoma growth and metastasis in a novel orthotopic human xenograft model. In Vivo. 23, 903-909 (2009).
- Odri, G. A. Zoledronic acid as a new adjuvant therapeutic strategy for Ewing’s sarcoma patients. 癌症研究. 70, 7610-7619 (2010).
- Merchant, M. S. Interferon gamma enhances the effectiveness of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor agonists in a xenograft model of Ewing’s sarcoma. 癌症研究. 64, 8349-8356 (2004).
- Hong, S. H. High neuropeptide Y release associates with Ewing sarcoma bone dissemination – in vivo model of site-specific metastases. Oncotarget. 6, 7151-7165 (2015).
- Lee, E. W. Neuropeptide Y induces ischemic angiogenesis and restores function of ischemic skeletal muscles. J Clin Invest. 111, 1853-1862 (2003).
- Tilan, J. U. Platelet neuropeptide Y is critical for ischemic revascularization in mice. FASEB J. , (2013).
- Toffoli, S., Michiels, C. Intermittent hypoxia is a key regulator of cancer cell and endothelial cell interplay in tumours. The FEBS journal. 275, 2991-3002 (2008).
- Das, B. Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction. Stem cells (Dayton, Ohio). 26, 1818-1830 (2008).
- Arndt, C. A., Rose, P. S., Folpe, A. L., Laack, N. N. Common musculoskeletal tumors of childhood and adolescence. Mayo Clin Proc. 87, 475-487 (2012).
- Mendoza, A. A novel noninvasive method for evaluating experimental lung metastasis in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52, 584-589 (2013).
- Feldman, D. B., Seely, J. C. . Necropsy Guide: Rodents and the Rabbit. , (1988).
- Parkinson, C. M. Diagnostic necropsy and selected tissue and sample collection in rats and mice. J Vis Exp. , (2011).
- Raymond, A. K., Lazar, A. J., PP, L. i. n., S, P. a. t. e. l. . Bone Sarcoma. , (2013).
- Dietel, M., Arps, H., Gerding, D., Trapp, M., Niendorf, A. Establishment of primary cell cultures: experiences with 155 cell strains. Klin Wochenschr. 65, 507-512 (1987).
- Varghese, A. J., Gulyas, S., Mohindra, J. K. Hypoxia-dependent reduction of 1-(2-nitro-1-imidazolyl)-3-methoxy-2-propanol by Chinese hamster ovary cells and KHT tumor cells in vitro and in vivo. 癌症研究. 36, 3761-3765 (1976).
