一种高通量、多重靶向蛋白质组学脑脊液检测方法，用于定量神经退行性生物标志物及载脂蛋白E亚型状态

摘要

我们描述了一种高通量、多重靶向的脑脊液（CSF）蛋白质组学检测方法，具有临床转化潜力。该检测可定量神经退行性变的潜在标志物和风险因素，例如载脂蛋白E的变异体（E2、E3和E4），并测量其等位基因表达水平。

摘要

许多神经退行性疾病是 仍然缺乏 有效治疗方案可靠的生物标志物对于识别和分类这些疾病在开发未来新型疗法中具有重要意义。通常 潜在的新生物标志物未能成功应用 进入临床 由于存在局限性 在其发育过程中 高成本。 然而， 使用三重四极杆质谱仪的多重反应监测液相色谱-串联质谱法（MRM LC-MS/MS）是一种可用于快速评估和验证生物标志物的靶向蛋白质组学方法 用于临床转化至诊断实验室。传统上，该平台已广泛用于小分子的检测 在临床实验室中，尽管该技术具有分析蛋白质的潜力，使其成为基于ELISA（酶联免疫吸附测定）方法的一种有吸引力的替代方案。本文描述了如何利用靶向蛋白质组学来检测和定量包括已知风险因子载脂蛋白E4同工型（ApoE4）在内的多种痴呆标志物。

为了使该检测方法适用于转化研究，其设计需具备快速、简便、高度特异且成本效益高的特点。为实现这一目标，必须针对所分析的特定蛋白质和组织，优化检测方法开发过程中的每一步。本方法描述了一个典型的工作流程，包括开发用于转化研究的靶向蛋白质组学MRM LC-MS/MS的多种技巧与注意事项。

通过使用定制合成的胰蛋白酶特征性定量肽进行方法开发和优化，这些肽用于校准 质谱仪以实现检测，随后被添加到脑脊液（CSF）中，以在质谱分析前确认内源性肽在色谱分离过程中的正确鉴定。为实现绝对定量，检测中还包含了带有短氨基酸序列标签并含有胰蛋白酶切割位点的稳定同位素标记内标肽段。

引言

阿尔茨海默病、路易体痴呆和帕金森病等神经退行性疾病日益增长的影响正在成为许多国家的社会经济问题¹。目前亟需更多 生物标志物，用于在疾病早期阶段识别和分类患者， 并监测任何潜在的新疗法。本方法的总体目标是建立一个通用的流程，以更高效、经济且快速的方式验证神经退行性疾病的潜在脑脊液标志物。其原理是采用靶向蛋白质组学或肽段多重反应监测液相色谱-串联质谱法（MRM LC-MS/MS），作为一种易于调整的方法，用于评估来自 发现阶段实验的多种潜在蛋白质生物标志物。这些标志物可在快速色谱分离（<10 分钟）过程中进一步实现多重检测与分析。在此项针对神经退行性生物标志物的多重筛查中，我们纳入了已知的痴呆风险因子载脂蛋白 E4 同工型（ApoE4），从而可同时确定其状态和表达水平，由此避免了单独进行基因分型检测的需要²。液相色谱-串联质谱法（LC MS/MS）通常被作为首选方法，用于对小分子进行精确定量，相较于 ELISA 或放射免疫分析法（RIA）等其他方法更具优势。质谱技术在蛋白质分析中的应用转变，主要由基于免疫的技术所存在的问题推动，这些问题包括交叉特异性、批次间差异、保质期有限以及成本高昂。因此，靶向蛋白质组学正迅速成为抗体依赖方法（如 Western blot、RIA 和 ELISA）的一种重要替代方案。然而，该技术相较于免疫学方法的主要优势在于能够将多个标志物整合到一次检测中³。该技术适用于多种组织样本，并已被广泛用作蛋白质组学研究....

方案

注意：本文所述整体方案的示意图见图1。本方法开发所用的所有样本均为临床诊断剩余样本，并已获得伦敦布鲁姆斯伯里伦理委员会的伦理批准。

图1. 创建靶向脑脊液MRM LC-MS/MS检测方法整体流程的示意图。 从蛋白质靶标中选择用于评估的候选标志肽。利用定制合成的肽段，建立靶向LC-MS/MS多重检测方法。经过评估后，该检测方法可用于评估神经退行性疾病潜在标志物的有效性。

1. 肽段的选择与设计

注意：标志物肽段的标准是必须具有唯一性（proteotypic），并能代表该蛋白质的定量丰度（quantotypic）。要确定某肽段是否具有唯一性，可使用 UniProt 网站（http://www.uniprot.org/blast/）....

结果

采用上述方法，开发了一种高通量、耗时10分钟的多重检测方法，包含来自54种蛋白质的74种肽段，用于检测神经退行性疾病阿尔茨海默病和路易体痴呆（LBD）的标志物⁸。图3展示了此前发表的该检测中关键肽段标志物的多重色谱图⁸。检测所包含的肽段及其定量离子转换信息见表2。该方法生成的数据为相对于相应稳定同位素标记内标的标准比值，这些数值可通过标准曲线换算为脑脊液（CSF）中绝对的pmol/100 µl浓度，并进一步对临床样本中的变化进行统计学分析。

如先前所述⁸，对该脑脊液（CSF）检测中包含的74种肽段进行定量分析后发现，其中25种生物标志物在痴呆症患者脑脊液中的水平发生显著改变。为说明本检测方法的有效性，图4展示了先前报道的痴呆相关标志物前食欲素（Pro-Orexin）和几丁质酶3样蛋白（Y.......

讨论

与所有基于质谱的检测方法一样，该方法的关键步骤在于确定内标物的适当且准确的用量。如果采用绝对定量，则标准曲线中加入的肽段的正确用量也至关重要。

我们的检测方法在质谱分析前无需对脑脊液进行沉淀处理，也无需使用任何净化或脱盐步骤。 这是一种完全的单容器反应方法。由于脑脊液（CSF）体积小且复杂性较低（相较于血浆），研究发现这些步骤可从最终方案中省略。 从而简化了检测流程，并使其更适用于转化应用 诊断环境。在主分析柱前连接预柱 溶剂在质谱方法中的延迟出现 足以在质谱运行过程中维持超过500个样本的检测灵敏度。由于该检测方法的超高效液相色谱运行时间较短，因此在脑脊液消化基质中明确鉴定出正确色谱峰至关重要。

这只能通过使用加标合成肽段和标准曲线来实现。如果对肽段是否匹配到正确的色谱峰存在不确定性，则可能需要 将样品通过多个跃迁通道，并利用合成标准品比对跃迁强度模式。我们的所有检测均包含至少两条肽段跃迁通道，以确认肽段的身份。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙腈（ACN），LC-MS 级	Fisher	A955-1
甲酸，LC-MS 级	Fisher	A117-50
二硫苏糖醇（DTT）	Sigma	D5545 - 5 g
盐酸，37% w/w	VWR	BDH3028 - 2.5 LG
碘乙酰胺	Sigma	I1149 - 5 g
氢氧化钠（NaOH）	Fisher	S318-500
胰蛋白酶，测序级，经修饰	Promega	V5113
三氟乙酸（TFA），LC-MS 级	Fisher	A116-50
尿素	Sigma	U0631- 500 g
水，LC-MS ULTRA Chromasolv	Fluka	14263
定制合成的脱盐肽段，1–4 mg	Genscript	custom
重同位素标记氨基酸[13C; 15N] 定制肽段	Genscript	custom
ASB 14	Merck Millipore	182750 - 25 g
硫脲	Sigma	T7875 - 500 g
Tris 碱	Sigma	T6066
VanGuard 预柱	Waters	186007125
Cortecs UPLC C18 + 1.6 μm  2.1 x 50 mm 色谱柱	Waters	186007114
酵母烯醇化酶	Sigma	E6126
300 μl 透明螺口玻璃小瓶	Fisher scientific	03-FISV
Y 型切口螺帽	Fisher scientific	9SCK-(B)-ST1X
冷冻干燥机	Edwards Mudulyo	Mudulyo system
浓缩仪/真空离心浓缩仪	Eppendof	concentrator plus 5301
Xevo -TQ-S 质谱仪	Waters
Acquity UPLC 系统	Waters