תפוקה גבוהה, Multiplexed וממוקדת proteomic CSF Assay לכמת Biomarkers ניווניות ו אפוליפופרוטאין E isoforms סטטוס
Summary
אנו מתארים תפוקה גבוהה, רב מפלסים, ואת הנוזל השדרתי proteomic ממוקד (CSF) assay שפותחה עם פוטנציאל תרגום קליני. הבדיקה יכולה לכמת סמנים פוטנציאל וגורמי סיכון עבור ניווניות של מערכת העצבים, כגון גרסאות E אפוליפופרוטאין (E2, E3 ו E4), ולמדוד ביטוי אללים שלהם.
Abstract
מחלות ניווניות רבות עדיין חסרות טיפולים יעילים. סמנים אמינים זיהוי וסיווג מחלות אלו יהיו חשובים בפיתוח טיפולים חדשניים בעתיד. לעתים קרובות סמנים ביולוגיים פוטנציאליים חדשים לא עושים את זה למרפאה בשל מגבלות בהתפתחותם והוצאות כבדות. עם זאת, פרוטאומיקה ממוקד באמצעות התגובה מרובות ניטור נוזלי כרומטוגרפיה-טנדם / ספקטרומטריית מסה (MRM LC-MS / MS), במיוחד באמצעות ספקטרומטרים המונית quadrupole משולשת, היא אחת השיטות שניתן להשתמש בהם כדי להעריך במהירות ולאמת ביומרקרים לתרגום קליניים לתוך מעבדות אבחון . באופן מסורתי, פלטפורמה זו נעשה שימוש נרחב עבור המדידה של מולקולות קטנות במעבדות קליניות, אבל זה פוטנציאל לנתח חלבונים, זה עושה את זה חלופה אטרקטיבית כדי ELISA (Enzyme-linked Immunosorהכפוף Assay) מבוסס שיטות. אנו מתארים כאן איך ממוקדות פרוטאומיקה ניתן להשתמש כדי למדוד סמנים מרובב של דמנציה, כולל איתור quantitation של גורם סיכון ידוע אפוליפופרוטאין E איזופורם 4 (ApoE4).
על מנת להפוך את assay מתאים תרגום, הוא נועד להיות מהיר, פשוט, מאוד ספציפי וחסכוני. כדי להשיג זאת, כל שלב בהתפתחות של assay חייב להיות מותאם עבור חלבונים בודדים ורקמות הם מנותחים. שיטה זו מתארת תהליך עבודה טיפוסי כולל טיפים שונים וטריקים כדי לפתח MRM פרוטאומיקה ממוקד LC-MS / MS לתרגום .
פיתוח שיטה מותאמת באמצעות גרסאות מסונתז מנהג פפטידים quantotypic tryptic, אשר לכייל את MS לגילוי ואז זינק לתוך CSF כדי לקבוע זיהוי נכון של הפפטיד האנדוגניים ההפרדה chromatographic לפני ניתוח של MS. כדי להשיג absoluquantitation te, שכותרתו איזוטופ יציב גרסאות תקן פנימי של פפטידים עם תגי רצף החומצות האמיניות קצר המכיל אתר מחשוף טריפסין, כלולים ב- assay.
Introduction
את ההשפעה ההולכת וגוברת של מחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר, דמנציה Lewy גוף ומחלת פרקינסון, הוא הופך לנושא החברתי-כלכלי במדינות רבות 1. יש צורך ב ביומרקרים נוספים שניתן להשתמש בהם כדי לזהות ולסווג לחולים בשלבים המוקדמים של המחלה, וכדי לפקח על כל טיפולים חדשים פוטנציאליים. המטרה הכללית של שיטה זו היא ליצור צבר המוצרים הגנריים דרך יעילה, כלכלית מהירה יותר של אימות סמנים CSF פוטנציאל מוחיים. הרציונל הוא להשתמש פרוטאומיקה ממוקד או הפפטיד MRM LC-MS / MS כשיטת amendable בקלות להעריך סמנים ביולוגיים חלבון פוטנציאל מרובים מניסויים גילוי. אלה יכולים להיות מרובבים נוספים על פירוד chromatographic מהיר (<10 דקות) והערכתי. בתוך מסך זמני זו עבור סמנים ביולוגיים ניווניות, כללנו את איזופורם אפוליפופרוטאין גורם סיכון לדמנציה הידוע E4 (ApoE4) כך אנו CAn לקבוע את מעמדה זמנית ורמת הביטוי, על ידי זה ביטול הצורך בדיקות גנוטיפ נפרד 2. LC MS / MS משמש באופן שגרתי כמו שיטת הבחירה של quantitating מולקולות קטנות במדויק על פני שיטות אחרות כגון ELISA או radioimmunoassay (RIA). שינוי זה השימוש בטכנולוגית MS לחלבונים לניתוח, כבר מונע בעיקר על ידי בעיות עם הטכנולוגיות מבוססות החיסוניות. אלה כוללים צולבות סגוליות, תצווה כדי וריאציה יצווה, חיי מדף מוגבלים, ועלות גבוהה. לכן, פרוטאומיקה ממוקד הופך במהירות אלטרנטיבה גוברת שיטות המבוססות נוגדנים כגון סופג, RIA ו ELISA המערבי. עם זאת, היכולת לבצע ריבוב סמנים רבים לתוך assay אחד הוא היתרון העיקרי של שיטה זו על פני שיטות מבוססות חיסוניות 3. הטכניקה ישימה ברקמות רבות ויש בו נעשה שימוש כאסטרטגיה אימות ללימודי פרוטאומיקה רבים, כולל פלזמה 4 ושתן 5,6.
טהchnique יכול להיות מיושם על כל מעבדה שיש לו גישה ומומחיות באמצעות ספקטרומטרים מונית quadrupole משולשות. עיצוב פפטיד הוא פשוט יחסית עם השימוש ההולך והגדל של מסדי נתוני קוד פתוחים. בשוק התחרותי של סינתזת פפטידים המותאם אישית עושה אותם הרבה יותר זול. פפטידים כבדים, עם זאת, הם יקרים ולכן הסמנים יש לבחון במדגם קטן לפני שעברתי בקנה מידה גדול יותר. קיים פוטנציאל הולך וגדל על הטכניקה כדי לשמש בהגדרות האבחון הקליניות, עם רוב בתי חולים הגדולים שיש פלטפורמות מבוססות quadrupole משולשות אשר ניתן להתאים בקלות להפעיל מבחני proteomic ממוקדים. אחד צרכימים האלה של השיטה, מה שהופך אותו לתוך הגדרת האבחון השגרתית, הוא היישום האחרון שלה כדי הקרנה כתם דם יילוד עבור חרמשי אנמיה 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
כמו בכל המבחנים המבוססים MS, השלבים הקריטיים בשיטה הם קביעת הסכומים המתאימים ומדויקים של סטנדרטים פנימיים. אם quantitation המוחלט נמצא בשימוש, אז את הכמויות הנכונות של פפטידים ממוסמרים בעקום התקן הם גם קריטיות.
assay שלנו אינו מחייב את המ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded and facilitated through the GOSomics research initiative by the National Institute for Health Research, Biomedical Research Centre at Great Ormond Street Hospital and the UCL Biological Mass Spectrometry Centre at the UCL Institute of Child Health with kind donations from the Szeban Peto Foundation. The Dementia Research Centre is an Alzheimer’s Research UK coordinating centre. The authors acknowledge the support of Alzheimer’s Research UK, the NIHR Queen Square Dementia Biomedical Research Unit, UCL/H Biomedical Research Centre, and Leonard Wolfson Experimental Neurology Centre.
Materials
| Acetonitrile (ACN), LC-MS grade | Fisher | A955-1 |
| Formic acid, LC-MS grade, | Fisher | A117-50 |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G |
| Hydrochloric acid, 37% w/w | VWR | BDH3028-2.5LG |
| Iodoacetamide | Sigma | I1149-5G |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher | S318-500 |
| Trypsin, sequencing grade, modified | Promega | V5113 |
| Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade | Fisher | A116-50 |
| Urea | Sigma | U0631-500g |
| Water, LC-MS ULTRA Chromasolv | Fluka | 14263 |
| Custom synthesised peptides desalted 1-4mg | Genscript | custom |
| heavy labelled amino acid [C13 N15] custom peptides | Genscript | custom |
| ASB 14 | Merck Millipore | 182750-25gm |
| Thiourea | Sigma | T7875-500G |
| Tris base | Sigma | T6066 |
| VanGuard precolumn | Waters | 186007125 |
| Cortecs UPLC C18+ 1.6um 2.1 x50mm column | Waters | 186007114 |
| Yeast Enolase | Sigma | E6126 |
| 300ul clear screw top glass vials | Fisher scientific | 03-FISV |
| Y slit screw caps | Fisher scientific | 9SCK-(B)-ST1X |
| Freeze dryer | Edwards Mudulyo | Mudulyo system |
| Concentrator/Speed vaccum | Eppendof | concentrator plus 5301 |
| Xevo -TQ-S mass spectrometer | Waters | |
| Acquity UPLC system | Waters |
References
- Prince, P. M., Guerchet, D. M., Prina, D. M., et al. . Policy Brief: The Global Impact of Dementia 2013-2050. , (2013).
- Hirtz, C., et al. Development of new quantitative mass spectrometry and semi-automatic isofocusing methods for the determination of Apolipoprotein E typing. Clin Chim Acta. 454, 33-38 (2015).
- Marx, V. Targeted proteomics. Nat Methods. 10 (1), 19-22 (2013).
- Heywood, W., et al. The development of a peptide SRM-based tandem mass spectrometry assay for prenatal screening of Down syndrome. J Proteomics. 75 (11), 3248-3257 (2012).
- Heywood, W. E., et al. Proteomic Discovery and Development of a Multiplexed Targeted MRM-LC-MS/MS Assay for Urine Biomarkers of Extracellular Matrix Disruption in Mucopolysaccharidoses I, II, and VI. Anal Chem. , (2015).
- Manwaring, V., et al. The identification of new biomarkers for identifying and monitoring kidney disease and their translation into a rapid mass spectrometry-based test: evidence of presymptomatic kidney disease in pediatric Fabry and type-I diabetic patients. J Proteome Res. 12 (5), 2013-2021 (2013).
- Moat, S. J., et al. Newborn blood spot screening for sickle cell disease by using tandem mass spectrometry: implementation of a protocol to identify only the disease states of sickle cell disease. Clin Chem. 60 (2), 373-380 (2014).
- Heywood, W. E., et al. Identification of novel CSF biomarkers for neurodegeneration and their validation by a high-throughput multiplexed targeted proteomic assay. Mol Neurodegener. 10, 64 (2015).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Manes, N. P., Mann, J. M., Nita-Lazar, A. Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification. J Vis Exp. (102), e52959 (2015).
- Craig-Schapiro, R., et al. YKL-40: a novel prognostic fluid biomarker for preclinical Alzheimer’s disease. Biol Psychiatry. 68 (10), 903-912 (2010).
- Perrin, R. J., et al. Identification and validation of novel cerebrospinal fluid biomarkers for staging early Alzheimer’s disease. PLoS One. 6 (1), e16032 (2011).
- Liguori, C., et al. Orexinergic system dysregulation, sleep impairment, and cognitive decline in Alzheimer disease. JAMA Neurol. 71 (12), 1498-1505 (2014).
