Tedavi Kan Retina Bariyer ihlali ve Potansiyel İlaçlar değerlendirilmesi için bir Akut Retina Modeli
Summary
Düşük maliyetli, kullanımı kolay ve güçlü bir sistem histamin tarafından uyarılan kan retina bariyer ihlali iyileştirecek potansiyel tedaviler değerlendirmek için kurulmuştur. Kan damarı sızıntı, Müller hücre aktivasyonu ve nöron sürekliliği bir potansiyel ilaç, Lipoksin A4 hasarı yanıtını ve ters değerlendirmek için kullanılır.
Abstract
A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An inflammatory factor, histamine, is demonstrated to compromise vessel integrity in the cultured retina through positive staining of IgG outside of the blood vessels. The effects of histamine itself and those of candidate drugs for potential treatments, such as lipoxin A4, are assessed using three parameters: blood vessel leakage via IgG immunostaining, activation of Müller cells via GFAP staining and change in neuronal dendrites through staining for MAP2. Furthermore, the layered organization of the retina allows a detailed analysis of the processes of Müller and ganglion cells, such as changes in width and continuity. While the data presented is with swine retinal culture, the system is applicable to multiple species. Thus, the model provides a reliable tool to investigate the early effects of compromised retinal vessel integrity on different cell types and also to evaluate potential drug candidates for treatment.
Introduction
Artan miktarda kanıt vücut kan retina bariyerinin (BRB) 1-5 ve kan beyin bariyeri (KBB) 6,7 olan benzerliği varlığını destekler. BBB Uzlaşma sıkıca böyle deliryum 10 olarak nedensel ya da Alzheimer hastalığı (AH) gibi kronik nörodejeneratif hastalıklar tanısal belirteç olarak 8,9 ve akut koşulları ile bağlantılı olmuştur. potansiyel ilaç hedefleri için bu patolojilerin ve keşifler içine mekanistik anlayışlar genellikle beynin sınırlı erişilebilirlik ve ağ karışıklık tarafından engellenmektedir. Bu, in vivo görüntüleme 11, beyin Organotipik kültürü 12, birincil hücre kültürleri 13,14 ve ko-kültür sistemleri 15 gibi alternatifler oluşturulmuştur. Ancak bu modellerin çoğu hücreleri tanımlamak için özel araçlar, uzun deneysel dönemleri veya birden fazla belirteçler gerektirir. Fonksiyonel ve yapısal BBB ile BRB arasındaki benzerlikler yanı sıra dy arasında bir korelasyoniki sfunctions 16-19 iddia edilmiştir. Buna ek olarak, daha kolay erişim, iyi tanımlanmış hücre tipleri ve tabakalı yapı beyne bir pencere olarak iyi karakterize edilmiş retina izin vermiştir. BBB ve BRB yapısal ve işlevsel kimlikler detaylı karşılaştırılması gerekmektedir. Bununla birlikte, retina hastalıkları, özellikle de BRB ihlali da sıkı bir şekilde diyabet 18-19 ve AD 21,22 dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların ilerlemesinin ile ilişkilendirilmiştir. Bu durumda, bir BRB disfonksiyon sistemi mekanizmasını tanımlamak için değil, aynı zamanda, potansiyel ilaç taranması için sadece kurmak ilgi çekicidir. Bu raporda, basit bir akut retinal kültürünü kullanarak bir protokol sağlayan BRB disfonksiyonu gelişti ve sunulmuştur.
Artmış BBB geçirgenliği ve AD-benzeri patolojik değişiklikler histamin, bir pro-inflamatuar arabulucu 12 ile inkübe bir beyin Organotipik kültürü kurulmuştur. Bu nedenle, sunulan sistemde, histamin İçi olduBRB disfonksiyonu ikna etmek için ex vivo retina kültürüne ied. Böyle Mus musculus ve Bos Boğa gibi çeşitli türlerden gelen retinaları, test edilmiştir. Nedeniyle ticari kullanılabilirliği ve insan dokusuna benzediği için, taze domuz gözbebekleri burada bildirilen veri sağlamak için kullanılmıştır. Histamin ve / veya diğer ilaçlar ile inkübe edildikten sonra, retinalar immünoglobülin G (IgG), kan ana bileşenden biri olarak bir kaç protein 12 için immün değerlendirme için işleme alınmıştır; Glial fibriller asidik protein (GFAP), glial aktivasyon için iyi bilinen bir işaretleyici; ve mikrotübül-ilişkili protein 2 (MAP2), mikrotübül montaj için gerekli bir nörona özgü sitoskeletal proteini. Bundan başka, retinanın tabakalı yapı gibi genişliği ve süreklilik değişiklikler olarak Müller hücrelerinin ve gangliyon hücreleri proseslerinin ayrıntılı bir analizini sağlar. Böylece birkaç ek parametreler sonuçlarını değerlendirmek için kullanılabilirBRB ihlali erken bir aşamada ve aynı zamanda potansiyel tedavilerin ters etkilerini değerlendirmek için.
kan damarlarının sızıntı (KZ), glial hücrelerin aktivasyonu ve nöronal hücrelerin hasar tepki: Bu protokol, ekranlı ilaçların potansiyel ters etkileri üç açıdan değerlendirilir. Çeşitli ölçümü yöntemleri, örneğin, ifade seviyesi immün bir süreç ve bir donanım filtresi tarafından gösterilen nöronal süreçlerin sürekliliği genişliği ölçüm yoğunluğu ile gösterilen, kullanılmaktadır. Daha iyi yöntemi göstermek için ve sonuçları yorumlamaya yardımcı olmak için, Lipoksin A4 (LXA4), endojen inflamatuar hasarına yanıt ve endotel disfonksiyonu 23 hafifletici sentezlenen bir bileşik, gösteri amaçlı seçilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
In this report, we present a powerful ex vivo acute retinal model of BRB dysfunction using the swine retina. This model system does not require special instruments and can be easily adapted under most laboratory settings. However, to obtain a successful result, several steps require close attention. After obtaining the eyeballs from the source, they must be kept at 4 °C or on ice and processed as soon as possible. When the effect of a treatment is being analyzed, two halves of the same retina must be used -…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bringhurst Meats (Berlin, NJ) is acknowledged for their genuine help in providing the swine eyeballs.
Materials
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
| HBSS | Life Technologies | 14170-112 | |
| Sucrose | J.T.Baker | 4072-05 | |
| Histamine | Sigma | H7125-1G | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | ||
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Freezing Media | Triangle Biomedical Sciences | TFM-5 | |
| Normal Goat Serum | Rockland | D104-00-0050 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| GFAP Antibody | Millipore | AB5804 | |
| MAP2 Antibody | EMD Millipore | MAB3418 | |
| FITC conjugated Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 711-095-152 | |
| Cy3 conjugated Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 715-165-150 | |
| mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories, Inc. | H-1200 | |
| Laser Confocal Microscope | Nikon | Eclipse Ti microscope | |
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.45s |
References
- Cunha-Vaz, J., Bernardes, R., Lobo, C. Blood-retinal barrier. J Ophthalmol. 21, 3 (2011).
- Kim, J. H., et al. Blood-neural barrier: intercellular communication at glio-vascular interface. J Biochem Molec Biol. 39, 339-345 (2006).
- Kumagai, A. K. Glucose transport in brain and retina: implications in the management and complications of diabetes. Diabetes Metab Res Rev. 15, 261-273 (1999).
- Runkle, E. A., Antonetti, D. A. The blood-retinal barrier: structure and functional significance. Methods Molec Biol. 686, 133-148 (2011).
- Takata, K., Hirano, H., Kasahara, M. Transport of glucose across the blood-tissue barriers. Int Rev Cytol. 172, 1-53 (1997).
- Goncalves, A., Ambrosio, A. F., Fernandes, R. Regulation of claudins in blood-tissue barriers under physiological and pathological states. Tissue Barriers. 1, 24782 (2013).
- Patton, N., et al. Retinal image analysis: concepts, applications and potential. Prog Ret Eye Res. 25, 99-127 (2006).
- Di Marco, L. Y., et al. Vascular dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer’s disease–A review of endothelium-mediated mechanisms and ensuing vicious circles. Neurobiol Dis. 82, 593-606 (2015).
- Nagele, R. G., et al. Brain-reactive autoantibodies prevalent in human sera increase intraneuronal amyloid-beta(1-42) deposition. J Alzheimer’s Dis: JAD. 25, 605-622 (2011).
- Goldwaser, E., Acharya, N., Nagele, R. Cerebrovascular and blood-brain barrier compromise: A mechanistic link between vascular disease and Alzheimer’s disease subtypes of neurocognitive disorders. J Parkinsons Dis Alzheimer’s Dis. 2, 10 (2015).
- Horton, N. G., et al. In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain. Nat Photonics. 7, (2013).
- Sedeyn, J. C., et al. Histamine Induces Alzheimer’s Disease-Like Blood Brain Barrier Breach and Local Cellular Responses in Mouse Brain Organotypic Cultures. Biomed Res Int. 2015, 937148 (2015).
- Avdeef, A., Deli, M. A., Neuhaus, W., Di, L., Kerns, E. H. . Blood-Brain Barrier in Drug Discovery: Optimizing Brain Exposure of CNS Drugs and Minimizing Brain Side Effects for Peripheral Drugs. , 188 (2014).
- Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10, 33 (2013).
- Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).
- Alberghina, M., Lupo, G., Anfuso, C. D., Moro, F. Palmitate transport through the blood-retina and blood-brain barrier of rat visual system during aging. Neurosci Lett. 150, 17-20 (1993).
- Hosoya, K., Yamamoto, A., Akanuma, S., Tachikawa, M. Lipophilicity and transporter influence on blood-retinal barrier permeability: a comparison with blood-brain barrier permeability. Pharm Res. 27, 2715-2724 (2010).
- Minamizono, A., Tomi, M., Hosoya, K. Inhibition of dehydroascorbic acid transport across the rat blood-retinal and -brain barriers in experimental diabetes. Biol Pharm Bull. 29, 2148-2150 (2006).
- Serlin, Y., Levy, J., Shalev, H. Vascular pathology and blood-brain barrier disruption in cognitive and psychiatric complications of type 2 diabetes mellitus. Cardiovasc Psychiatry Neurol. 2011, 609202 (2011).
- Kolb, H. How the retina works – Much of the construction of an image takes place in the retina itself through the use of specialized neural circuits. Am Sci. 91, 28-35 (2003).
- Ikram, M. K., Cheung, C. Y., Wong, T. Y., Chen, C. P. Retinal pathology as biomarker for cognitive impairment and Alzheimer’s disease. J Neurol Neurosurgery Psychiatry. 83, 917-922 (2012).
- Tan, Z., Ge, J. Amyloid-beta, the retina, and mouse models of Alzheimer disease. Am J Pathol. 176, 2055 (2010).
- Serhan, C. N. Pro-resolving lipid mediators are leads for resolution physiology. Nature. 510, 92-101 (2014).
- Bucolo, C., et al. Effects of topical indomethacin, bromfenac and nepafenac on lipopolysaccharide-induced ocular inflammation. J Pharm Pharmacol. 66, 954-960 (2014).
- Edelman, J. L., Lutz, D., Castro, M. R. Corticosteroids inhibit VEGF-induced vascular leakage in a rabbit model of blood-retinal and blood-aqueous barrier breakdown. Exp Eye Res. 80, 249-258 (2005).
