のジェノタイピング<em>黄色ブドウ球菌</em>によってリボソームスペーサーPCR（RS-PCR）

Summary

Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.

Abstract

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, therefore, suitable to be used for routine purposes. For best resolution, data evaluation and data management, a miniaturized electrophoresis system is required. Together with such an electrophoresis system and the in-house developed software (freely available here) assignment of the pattern of bands to a genotype is standardized and straight forward. DNA extraction is simple (boiling prep), setting-up of the reactions is easy and they can be run on any standard PCR machine. PCR cycling is common except prolonged ramping and elongation times. Compared to spa typing and Multi Locus Sequence Typing (MLST), RS-PCR does not require DNA sequencing what simplifies the analysis considerably and allows a high throughput. Furthermore, the resolution for bovine strains of S. aureus is at least as good as spa typing and better than MLST or pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The RS-PCR data base includes presently a total of 141 genotypes and variants. The method is highly associated with the virulence gene pattern, contagiosity and pathogenicity of S. aureus strains involved in bovine mastitis. S. aureus genotype B (GTB) is contagious and causes herds problems causing large costs in the Switzerland and other European countries. All the other genotypes observed in Switzerland infect individual cows and quarters. Genotyping by RS-PCR allows the reliable prediction of the epidemiological and the pathogenic potential of S. aureus involved in bovine intramammary infection (IMI), two key factors for clinical veterinary medicine. Because of these beneficial properties together with moderate costs and a high sample throughput the goal of this publication is to give a detailed, step-by-step protocol for easily establishing and running RS-PCR for genotyping S. aureus in other laboratories.

Introduction

ブドウ （ 黄色ブドウ球菌）は、牛¹における乳房内感染（IMI）のための世界的な責任を最も重要な病原体として知られています。欧州12カ国というの牛でCosandey ら ³及びボスら ⁴によりフルニエら ²スイス牛で実証・研究による研究S.ウシIMIから分離された黄色ブドウ球菌は、遺伝的に不均一な群です。 16S-23S rRNAの遺伝子間スペーサー領域のPCR増幅（RS-PCR）により、17遺伝子型の合計は、最初に101疫学的に独立した単離物²で検出されました。他の15の遺伝子型（GTS）は、各すべての分離株の1〜4％を作り、まれに発生していないのに対し、遺伝子型Bと遺伝子型C（GTC）は、（80％）が最も一般的でした。欧州レベル³では、GTBは、GTCは、GTF、GTI、およびGTRは、すべての分析株（N = 456）の76％を含む、最も重要な遺伝子型でした。 GTBは、ワット中央ヨーロッパに位置していましたhereas他の遺伝子型は、広く普及しました。株の残りの24％は41の遺伝子型が含まれ、それらの多くは、しかし、一度のみ観察されました。

フルニエ者らの研究ら ^2、Cosandey ら ^3、及びグラバーら ^5は、さらに^、遺伝子型が非常に欧州レベルでのように、スイスで、ならびに、それらの病原性遺伝子のパターンと関連していたことを実証しました。研究はさらにS.間のIMIの有病率の大幅な違いを明らかにしました球菌 GTB、GTCおよび他の遺伝子型^2,5：GTB考慮して、群れでの牛の87％までは、この遺伝子型に感染していました。 GTCのと他の遺伝子型の場合には、しかし、IMIは唯一の群れの1〜2頭の牛に認められました。

IMI S.によって引き起こされます黄色ブドウ球菌は 、通常、対応する乳腺の炎症および乳中の炎症細胞の増加をもたらします。その結果、体細胞の共同乳中のunts（SCC）、ほとんどの国で乳質の重要な指標は、減少した牛乳の価格、あるいは配信停止につながる増加されます。

フルニエら ²のRS-PCRに加えて、他のタイプの方法は、Sのウシ株サブタイプについて記載されています球菌 ^8-11。 2つの一般的なものは、 スパタイピング ¹²と多座配列タイピング^{（MLST）13が}含まれます。後者の1が7ハウスキーピング遺伝子の塩基配列決定を必要とするのに対し、前者は、プロテインAのブドウ球菌スパコードする遺伝子の可変スペーサー領域の配列を決定するDNAに基づいています。これは、1つの¹²および7のPCR ^13は 、それぞれ、特定の装置を使用してアンプリコンの精製、配列決定反応及び分析を行い、実行する必要があることを意味します。 RS-PCRと比較すると、これらの方法は、低いサンプルスループットと高いコストが生じ、実験室にかなりの付加的な努力を必要とします。ザスループットは、PFGEのために特に低いです。 S.のウシの株について、これらの方法の解像度を考慮すると黄色ブドウ球菌 、RS-PCRは、少なくともMLST ⁴またはPFGE ¹⁵より^4、より良いと入力し、スパと同じくらい良いです。

バイナリタイピング¹³を含むすべてのこれらの方法は、Sによって引き起こされるウシIMIの病因にさらなる洞察を得ることにその有効性を実証しました黄色ブドウ球菌 、しかし理由述べた制限の彼らは、大規模な臨床研究にはあまり適しています。また、RS-PCRによる遺伝子型決定フルニエらによって記載されているように^2は 、疫学的及びS.の病原性の可能性のある信頼性の高い予測を可能にしますウシIMIに関与球菌 、臨床獣医学における2のキー値。

Protocol

1. 黄色ブドウ球菌分離株 S.10μlのスプレッド黄色ブドウ球菌株培養または1つのコロニーを5％ヒツジ血液（BA）を含むコロンビア寒天プレート上で選択培地上で増殖させました。 24時間〜18時間、37℃で好気的に培養します。 2. DNA抽出 10 mMトリス-塩酸および10mMのNa 2 EDTA、pHが8.5を含むTELバッファを準備します?…

Representative Results

遺伝子型とその変種の定義すべての識別された遺伝子型から複数の帯域が異なる電気泳動プロファイルが新たな遺伝子型であると考えられます。新しい遺伝子型に名前を付けて拡張フルニエらによると。5 GTZにGTAの遺伝子型につながる、GTBZに遺伝子型GTAZにGTAA、およびGTBAが続き、現在ではGTCCにGTCAさ?…

Discussion

RS-PCR（> 30純粋なDNA /アッセイをNG）におけるDNAの過剰がある場合手順全体の最も重要なステップがある^2。そのすべてのピークがベースラインから始まり、最後ならば一般的には、プロファイルの解像度が最適です。 2つのピークが一緒に近すぎる場合は、解像度が不完全です。手動識別が必要とされるように、これらの条件下では、バイオアナライザーソフトウェアが不適切なピ?…

Materials

Tris(hydroxymethyl)-aminomethan	Merck	1.08382.0500	Mw =121.14g/mol
Titriplex III	Merck	1.08418.0250	Mw = 372.24g/mol; Substance is equivalent to Na2EDTA·2H2O
Hydrochloric acid 5mol/l	Merck	1.09911.0001
Columbia agar+5% sheep blood	bioMérieux	43049
Agilent DNA7500 Kit	Agilent Technologies	5067-1504
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2940CA
Agilent 2100 expert sofware	Agilent Technologies
HotStarTaq master mix	Qiagen	203445
Primer L1	Mycrosinth		5'CAA GGC ATC CAC CGT3'
Primer G1	Mycrosinth		5'GAA GTC GTA ACA AGG3'