En utilisant le composé d'éthylène de libération, l'acide 2-chloroéthylphosphonique, comme un outil pour étudier la réponse de l'éthylène chez les bactéries
Summary
The protocols outlined herein facilitate the convenient investigation of bacterial ethylene responses by utilizing 2-chloroethylphosphonic acid (CEPA). Ethylene is produced in situ through the decomposition of CEPA in an aqueous bacterial growth medium, circumventing the requirement for pure ethylene gas.
Abstract
Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ripening. Exogenous ethylene applied during early plant development triggers the triple response phenotype; a shorter and thicker hypocotyl with an exaggerated apical hook. Despite the intimate relationship between plants and bacteria, the effect of exogenous ethylene on bacteria has been greatly overlooked. This is partly due to the difficulty of controlling gaseous ethylene within the laboratory without specialized equipment. 2-Chloroethylphosphonic acid (CEPA) is a compound that decomposes into ethylene, chlorine, and phosphate in a 1:1:1:1 molar ratio when dissolved in an aqueous medium of pH 3.5 or greater. Here we describe the use of CEPA to produce in situ ethylene for the investigation of ethylene response in bacteria using the fruit-associated, cellulose-producing bacterium Komagataeibacter xylinus as a model organism. The protocols described herein include both the verification of ethylene production from CEPA via the Arabidopsis thaliana triple response assay and the effects of exogenous ethylene on K. xylinus cellulose production, pellicle properties and colonial morphology. These protocols can be adapted to examine the effect of ethylene on other microbes using appropriate growth media and phenotype analyses. The use of CEPA provides researchers with a simple and efficient alternative to pure ethylene gas for the routine determination of bacterial ethylene response.
Introduction
L'éthylène oléfine (C 2 H 4) a d' abord été découvert comme une hormone végétale en 1901 quand il a été observé que les semis de pois, cultivés dans un laboratoire qui utilise des lampes à gaz de charbon, présentaient une morphologie anormale dans laquelle les tiges (hypocotyles) étaient plus courtes, plus épais et courbé latéralement par rapport aux semis de pois normaux; un phénotype appelé plus tard , le 1,2 triple réponse. Des études ultérieures ont démontré que l' éthylène est une phytohormone vitale qui régule de nombreux processus de développement tels que la croissance, la réponse au stress, la maturation des fruits et de la sénescence 3. Arabidopsis thaliana, un organisme modèle pour la recherche en biologie végétale, a été bien étudiée en ce qui concerne sa réponse à l' éthylène. Mutants de réponse Plusieurs d'éthylène ont été isolés en exploitant le phénotype triple réponse observée dans l' obscurité-adulte A. semis thaliana en présence d'éthylène 1,4,5. Le précurseur biosynthétique pour la production d'éthylène dans les plantes est 1-aacide minocyclopropane carboxylique (ACC) 6 et est couramment utilisé pour le dosage de la triple réponse pour augmenter la production endogène d'éthylène qui conduit à la triple réponse 1,4,5 phénotype.
Bien que la réponse à l'éthylène est largement étudié dans les plantes, l'effet de l'éthylène exogène sur les bactéries est largement sous-étudiée en dépit de l'étroite association de bactéries avec des plantes. Une étude a rapporté que certaines souches de Pseudomonas peuvent survivre à l' aide d' éthylène en tant que source unique de carbone et d' énergie 7. Cependant, seules deux études ont démontré que les bactéries réagissent à l'éthylène. La première étude a montré que les souches de Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, P. putida et P. syringae étaient chimiotactique envers l' éthylène en utilisant un essai de bouchon d' agarose dans lequel l' agarose fondu a été mélangé avec un tampon de chimiotaxie éthylène pur équilibrée avec du gaz 8. Cependant, à notre connaissance, il n'y a pas eu de further rapports en utilisant de l'éthylène gazeux pur pour caractériser la réponse d'éthylène bactérienne, probablement en raison de la difficulté de manipulation des gaz dans le laboratoire sans matériel spécialisé. Le deuxième rapport de la réponse à l'éthylène bactérienne a démontré que l' éthylène a augmenté la production de cellulose bactérienne et l' expression des gènes influencés dans la bactérie de fruits associée, Komagataeibacter (anciennement Gluconacetobacter) xylinus 9. Dans ce cas, le composé libérant de l' éthylène, l' acide 2-chloréthylphosphonique (CEPA) a été utilisé pour produire de l' éthylène in situ dans le milieu de croissance bactérienne, en évitant la nécessité d'éthylène gazeux pur ou d'un équipement spécialisé.
LCPE produit de l' éthylène à un rapport 1: 1 molaire pH supérieur à 3,5 10,11 à travers, une réaction de premier ordre catalysée par une base 12-14. La dégradation de la LCPE est positivement corrélée avec le pH et la température 13,14 et les résultats dans la production d'éthylène, le chlorure et le phosphate. CEPA offre aux chercheurs intéressés à étudier les réponses bactériennes à l'éthylène avec une alternative pratique à l'éthylène gazeux.
L'objectif global des protocoles suivants est de fournir une méthode simple et efficace pour étudier la réponse d'éthylène bactérienne et comprend la validation des niveaux physiologiquement pertinents de la production d'éthylène de la LCPE décomposition dans un milieu de croissance bactérienne, l'analyse de la culture pH pour assurer la LCPE décomposition ne soit pas compromise pendant la croissance bactérienne, et l'évaluation de l'effet de l'éthylène sur la morphologie et le phénotype bactérien. Nous démontrons ces protocoles utilisant K. xylinus Toutefois, ces protocoles peut être adapté pour étudier la réponse de l' éthylène dans d' autres bactéries en utilisant le milieu de croissance approprié et analyse le phénotype.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les méthodes décrites ici décrivent la production in situ de l' éthylène à partir CEPA pour l'étude de la réponse à l'éthylène bactérien en utilisant l'organisme modèle, K. xylinus. Cette méthode est très utile que l' éthylène peut être produit en complétant tout milieu aqueux qui présente un pH supérieur à 3,5 à 10,11 CEPA niant la nécessité d'éthylène gazeux pur ou de l' équipement de laboratoire spécialisé. Ce procédé ne se limit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Dario Bonetta for providing Arabidopsis thaliana seeds and for technical assistance in regards to the triple response assay, as well as Simone Quaranta for help with FT-IR. This work was supported by a Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (NSERC-DG) to JLS, an Ontario Graduate Scholarship (OGS) to RVA, and a Queen Elizabeth II Graduate Scholarship in Science and Technology (QEII-GSST) to AJV.
Materials
| 1-aminocyclopropane carboxylic acid (ACC) | Sigma | A3903 | Biosynthetic precursor of ethylene in plants |
| 4-sector Petri dish | Phoenix Biomedical | CA73370-022 | For testing triple response |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | To solidify medium |
| Canon Rebel T1i DLSR camera | Canon | 3818B004 | For pictures of pellicles |
| Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 | Sigma | C2730 | Aqueous solution |
| Citric acid | BioShop | CIT002.500 | For SH medium |
| Commercial bleach | Life Brand | 57800861874 | Bleach for seed sterilization |
| Concentrated HCl | BioShop | HCL666.500 | Hydrochloric acid for pH adjustment |
| Digital USB microscope | Plugable | N/A | For pictures of colonies |
| Ethephon (≥ 96%; 2-chloroethylphosphonic acid) | Sigma | C0143 | Ethylene-releasing compound |
| Glucose | BioBasic | GB0219 | For SH medium |
| Komagataeibacter xylinus ATCC 53582 | ATCC | 53582 | Bacterial cellulose-producing alphaproteobacterium |
| Microcentrifuge tube | LifeGene | LMCT1.7B | 1.7 mL microcentrifuge tube |
| Murashige and Skoog (MS) basal medium | Sigma | M5519 | Arabidopsis thaliana growth medium |
| Na2HPO4·7H2O | BioShop | SPD579.500 | Sodium phosphate, dibasic heptahydrate for SH medium |
| NaCl | BioBasic | SOD001.1 | Sodium chloride for saline and control solution |
| NaH2PO4·H2O | BioShop | SPM306.500 | Sodium phosphate, monobasic monohydrate for control solution |
| NaOH | BioShop | SHY700.500 | Sodium hydroxide for pH adjustment |
| Paraffin film | Parafilm | PM996 | For sealing plates and flasks |
| Peptone (bacteriological) | BioShop | PEP403.1 | For SH medium |
| Petroff-Hausser counting chamber | Hausser scientific | 3900 | Bacterial cell counting chamber |
| Polyethersulfone sterilization filter 0.2 µm | VWR | 28145-501 | For sterilizing cellulase |
| Sucrose | BioShop | SUC600.1 | Sucrose for MS medium |
| Yeast extract | BioBasic | G0961 | For SH medium |
References
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