Summary

Générateur<em> De Novo</em> Spécifiques de l'antigène T Human cellulaires Receptors par rétrovirale transduction de Centric Hemichain

Published: October 25, 2016
doi:

Summary

Nous décrivons ici une nouvelle méthode pour produire des récepteurs de cellules T spécifiques de l'antigène (TCR) par couplage du TCRa ou TCRβ d'un TCR existant, possédant l'antigène de la spécificité d'intérêt, avec hemichain complémentaire du répertoire des récepteurs des cellules T périphériques. Les TCR de novo générés conservent l' antigène de spécificité avec une affinité variable.

Abstract

Les récepteurs des cellules T (TCR) sont utilisés cliniquement pour diriger la spécificité des lymphocytes T à cibler des tumeurs en tant que modalité prometteuse de l'immunothérapie. Par conséquent, le clonage des TCR spécifiques de divers antigènes associés à des tumeurs a été l'objectif de nombreuses études. Pour provoquer une réponse efficace des lymphocytes T, le TCR doit reconnaître l'antigène cible avec une affinité optimale. Cependant, le clonage tel TCR a été un défi et beaucoup disponibles TCR possèdent une affinité sous-optimale pour l'antigène correspondant. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode de clonage de novo TCR spécifiques de l'antigène à haute affinité en utilisant des TCR existants en exploitant hemichain centricity. Il est connu que pour certains TCR, chacun TCRa ou TCRβ hemichain ne contribuent également à la reconnaissance de l'antigène, et le hemichain dominant est désigné sous le nom hemichain centrée. Nous avons montré que par l'appariement du hemichain centric avec des contre-chaînes différentes de la contre-chaîne d'origine, nous sommes en mesure de maintenir l'antigène specificity, tout en modulant sa force d'interaction pour l'antigène correspondant. Ainsi, le potentiel thérapeutique d'un TCR donné peut être améliorée en optimisant l'appariement entre les centriques et la contre-hemichains.

Introduction

Les récepteurs des cellules T (TCR) sont des récepteurs immunitaires adaptatives hétérodimères exprimés par les lymphocytes T, constitués d'une chaîne TCRa et TCRβ. Elles sont produites par un réarrangement somatique de V (D) des segments de gène J, qui produit un répertoire très diversifié capable de reconnaître des configurations pratiquement illimitées de complexes HLA / peptide. Cliniquement, les cellules T modifiées pour exprimer clonotypique spécifiques des TCR pour des antigènes associés à une tumeur ont montré une efficacité dans une variété de cancers 1. Cependant, de nombreux clones de TCR à cet effet, ne disposent pas une affinité suffisante pour l'antigène d'intérêt, ce qui limite leur application thérapeutique.

Ici, nous décrivons une méthode pour surmonter cette limitation pour les TCR existants en exploitant la chaîne Centricity. Il a été rapporté que l' un hemichain TCR pourrait jouer un rôle plus important dans la reconnaissance de l'antigène cible 2, appelé ici centricity. analyses structurales de Crystal ont montré que l'une centréehemichain d'un TCR pourrait représenter la majorité de l'empreinte sur le CMH / peptide complexe 3,4. En utilisant ce concept, nous avons déjà démontré que le SIG35α TCRa peut jumeler avec un répertoire varié de chaînes TCRβ et maintenir la réactivité contre le peptide MART1 27-35 présenté par HLA-A2 5. Des résultats similaires ont été obtenus avec le RCT TAK1, où le hemichain TCRβ centré sur apparié avec différentes chaînes TCRa et maintenu la réactivité du peptide 235-243 WT1 présenté par HLA-A24 6. Deux MART1 et WT1 sont des antigènes associés aux tumeurs. Chain-centricity a également été appliquée à l' étude reconnaissance de l' antigène des cellules tueuses naturelles (iNKT) TCR invariants CD1d-restreintes, en associant l'invariant chaîne Vα24-Jα18 (Vα24i) TCRa des TCR iNKT humaines avec différentes chaînes Vβ11 TCRβ 7.

Dans tous les cas, nous avons été en mesure de générer un répertoire de novo de TCR par transduction du TCR hemichain centrée sur les cellules T du sang périphérique, où le hemichain introduit jumelé avec le TCRa endogène ou TCRβ contre-chaînes. En substance, la hemichain centrée sert d'appât qui peut être utilisé pour identifier les contre-chaînes appropriées, qui forment ensemble une fois appareillé TCR qui maintiennent la spécificité de l'antigène d'intérêt, mais variant d'affinité. De ces nouveaux répertoires, nous avons été en mesure d'isoler TCR clonotypiques avec une meilleure résistance à l'interaction contre l'antigène cible par rapport à TCR pré-existantes. Par conséquent, nous croyons que cette méthode permettra d'accélérer le pipeline d'identifier les TCR optimales pour l'application clinique.

Protocol

1. Préparation de rétrovirale codant pour TCR Hemichain d'intérêt Linéariser pMX vecteur pour permettre l'insertion d'un gène de TCR dans des étapes ultérieures. Digérer l'ADN du plasmide avec EcoRI et Notl enzymes de restriction à 37 ° C pendant 3 heures ( voir le tableau 1) 8. Effectuer une électrophorèse du plasmide digéré sur un gel d'agarose à 1,2%. Bande d'accise d'environ 4500 paires de bases (pb), et éluer dans 30 ul d&…

Representative Results

Sans connaissance préalable de ce qui est hemichain chaîne centrée, la chaîne TCRa et TCRβ devrait être cloné séparément et transduction des cellules T du sang périphérique, qui a été fait dans le cas de HLA-A24 / WT1 réactive TAK1 TCR (Figure 1). Transduction de TAK1β a abouti à une fréquence sensiblement plus élevée de lymphocytes T spécifiques de l'antigène. A l' inverse, la transduction d'un hemichain non-centric ne donnerait pas …

Discussion

La première exigence pour une bonne application de ce procédé réalise l'efficacité de transduction suffisante de cellules T primaires avec le hemichain d'intérêt. Dans notre expérience, la combinaison de l'utilisation de PG13 comme lignée cellulaire d'emballage et pMX que les résultats de vecteurs rétroviraux dans l'expression stable et efficace du gène introduit dans les cellules T humaines primaires. les cellules d'emballage PG13 peuvent être une seule cellule clonée pour sélecti…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by NIH grant R01 CA148673 (NH); the Ontario Institute for Cancer Research Clinical Investigator Award IA-039 (NH); BioCanRX Catalyst Grant (NH); The Princess Margaret Cancer Foundation (MOB, NH); Canadian Institutes of Health Research Canada Graduate Scholarship (TG); Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Postgraduate Scholarship (TG); Province of Ontario (TG, MA); and Guglietti Fellowship Award (TO). HLA and CD1d monomers were kindly provided by the NIH tetramer core facility.

Materials

0.05% Trypsin-EDTA Wisent Bioproducts 325-043-CL
293GPG cells Generated by Ory et al. (ref 8)
Agar Wisent Bioproducts 800-010-CG
Agarose Wisent Bioproducts 800-015-CG
Ampicillin sodium salt Wisent Bioproducts 400-110-IG
Chloroform BioShop CCL402
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix New England Biolabs N0447L
DMEM, high glucose, pyruvate Life Technologies 11995065
EcoRI New England Biolabs R0101S
EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit BS353
Fetal Bovine Serum Life Technologies 12483020
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 17-1440-02
Filter Corning 431220 0.45 mm pore SFCA membrane
FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAb Biolegend 345104 clone ME20.4
FITC-conjugated anti-human CD3 mAb Biolegend 300440 clone UCHT1
Gentamicin Life Technologies 15750078
Gibson Assembly Master Mix New England Biolabs E2611L used for multi-piece DNA assembly
HLA-A2 pentamer Proimmune depends on antigenic peptide HLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune
HLA/CD1d monomers NIH Tetramer Core Facility multimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility
Human AB serum Valley Biomedical HP1022
human CD3 microbeads Miltenyi Biotec 130-050-101
IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit Beckman Coulter IM3497
Jurkat 76 cells Generated by Heemskerk et al. (ref 10)
LB Broth Wisent Bioproducts 800-060-LG
LS MACS column Miltenyi Biotec 130-042-401
NEB 5-alpha Competent E. coli New England Biolabs C2987I
NEBuffer 3.1 New England Biolabs B7203S used for EcoRI and NotI digestion
NotI New England Biolabs R0189S
NucleoBond Xtra Midi Macherey-Nagel 740410 used for plasmid purification
PC5-conjugated anti-human CD8 mAb Beckman Coulter B21205 clone B9.11
PG13 cells ATCC CRL-10686
Phusion HF Buffer Pack New England Biolabs B0518S
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0530L
pMX retroviral vector Cell Biolabs RTV-010
polybrene Sigma-Aldrich H-9268
Proleukin (recombinant human interleukin-2) Novartis by Rx only equivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich
Purified anti-human CD3 antibody Biolegend 317301 clone OKT3, used for T cell stimulation
RPMI 1640 Life Technologies 11875119
SA-PE Life Technologies S866 used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility
SMARTer RACE 5'/3'  Kit Clontech 634858
Sterile water Wisent Bioproducts 809-115-LL
SuperScript III First-Strand Synthesis System Invitrogen 18080051 for cDNA synthesis
Syringe BD 301604 10 mL, slip tip
Tetracycline hydrochloride Sigma-Aldrich T7660
TransIT-293 Mirus Bio MIR 2700 used to transfect 293GPG cells
TRIzol Reagent Life Technologies 15596026

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Cite This Article
Guo, T., Ochi, T., Nakatsugawa, M., Kagoya, Y., Anczurowski, M., Wang, C., Rahman, M. A., Saso, K., Butler, M. O., Hirano, N. Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain. J. Vis. Exp. (116), e54697, doi:10.3791/54697 (2016).

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