Zebrafish are emerging as a valuable model of dietary lipid processing and metabolic disease. Described are protocols of lipid-rich larval feeds, live imaging of dietary fluorescent lipid analogs, and quantification of food intake. These techniques can be applied to a variety of screening, imaging, and hypothesis driven inquiry techniques.
Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich meal, which consists of an emulsion of chicken egg yolk liposomes created by sonicating egg yolk in embryo media. Detailed instructions are provided to screen larvae for egg yolk consumption so that larvae that fail to feed will not confound experimental results. The chicken egg yolk liposomes can be spiked with fluorescent lipid analogs, including fatty acids and cholesterol, enabling both systemic and subcellular visualization of dietary lipid processing. Several methods are described to mount larvae that are conducive to short- and long-term live imaging with both upright and inverted objectives at high and low magnification. Additionally presented is an assay to quantify larval food intake by extracting the lipids of larvae fed fluorescent lipid analogs, spotting the lipids on a thin layer chromatography plate, and quantifying the fluorescence. Finally, critical aspects of the procedures, important controls, options for modifying the protocols to address specific experimental questions, and potential limitations are discussed. These techniques can be applied not only to focused, hypothesis driven inquiries, but also to a variety of screens and live imaging techniques to study dietary lipid metabolism and the control of food intake.
Механизмы, с помощью которых кишка регламентирует диетическую обработку липидов, печень контролирует сложный синтез липидов и липопротеинов обмен веществ, и как эти органы работают с центральной нервной системой, чтобы контролировать потребление пищи не полностью поняты. Это биомедицинской интерес для выяснения этого биологии в свете нынешних эпидемий ожирения, сердечно-сосудистых заболеваний, диабета и неалкогольного жировой болезни печени. Исследования в культуре клеток и мыши обеспечили большую часть нашего понимания механистических отношений между диетическими липидов и болезни, и данио (Danio rerio) появляются в качестве идеальной модели , чтобы дополнить эту работу.
Рерио имеют аналогичные органы желудочно – кишечного тракта (ЖКТ), липидный обмен и липопротеинов транспорт до высших позвоночных 1,2, быстро развиваются, и генетически послушный. Оптическая прозрачность личиночной данио облегчает в естественных условиях исследования, A particulaг преимуществом для изучения системы GI как его внеклеточной среде (то есть, желчи, микрофлора, эндокринные сигнализации) практически невозможно смоделировать ех естественных условиях. В соответствии, орган исследований объединения генетического удобство манипулирования и факторов, способствующих выполнению живых изображений данио личинок с разнообразие диетических манипуляций ( с высоким содержанием жиров 3,4, -холестерина 5 и -carbohydrate диет 6,7), а также модели сердечно – сосудистых заболеваний 8, диабет 9,10, стеатоз печени 11-13, 14-16 и ожирение, появляются, чтобы обеспечить множество метаболических идей.
Важным аспектом перехода личиночной данио в метаболические исследования является оптимизация методик, разработанных в других модельных животных к данио и разработке новых анализов, которые используют уникальные сильные стороны данио. Этот протокол представляет методы разработаны и оптимизированы, чтобы накормить личиночной данио липиd-богатая пища, визуализировать диетическую обработку липидов от всего тела к внутриклеточной резолюции, и измерить потребление пищи. Куриный яичный желток был выбран, чтобы составить с высоким содержанием липидов пищи, как она содержит большое количество жиров и холестерина (липидов составляют ~ 58% из куриного желтка, из которых ~ 5% холестерина, 60% являются триглицеридами, а 35% являются фосфолипиды ). Куриный яичный желток содержит больше жира , чем обычные коммерческие данио микропеллет продуктов питания (~ 15% липидов) и тем преимуществом , что она представляет собой стандартизированный корм с известными процентным содержанием определенных видов жирных кислот, так как данио диеты и кормления полки не были стандартизированы в лабораториях 17. Кроме того, флуоресцентные аналоги липида , представленные в яичном желтке визуализации транспорта и накопления пищевых липидов 18, изображение клеточных компонентов , включая липидные капли, действуя как в качестве жизненно важных красителей 3 и через ковалентного включения в сложные липиды, исследовать метаболизм через тонкослойной хроматографии (ТСХ) 19 </sup> И высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (ФСП неопубликованные данные), а также обеспечить количественный анализ для общего потребления пищи 20.
Методы, описанные здесь, позволяют исследователям для лечения личиночной данио с богатой липидами корма, визуализировать диетическое обработку липидов в живых личинок, и количественно личиночной потребление пищи. Для того, чтобы обеспечить успех, особое внимание следует уделить неск…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Meng-Chieh Shen for images, Jennifer Anderson for providing helpful comments on the manuscript, and members of the Farber laboratory for their contributions in developing these techniques. This study was funded by NIDDK-NIH award RO1DK093399 (S.A.F.), RO1GM63904 (The Zebrafish Functional Genomics Consortium: PI Stephen Ekker and Co-PI S.A.F), and F32DK096786 (J.P.O.). This content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of NIH. Additional support was provided by the G. Harold and Leila Y. Mathers Charitable Foundation to the laboratory of S.A.F and the Carnegie Institution for Science endowment.
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulofnate salt) | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Anesthesia for larval zebrafish |
Chicken eggs | N/A | N/A | Organic, cage-free eggs, not enriched for omege-3 fatty acids |
Ultrasonic processor 3000 sonicator | Misonix, Inc. | S-3000 | To make egg yolk liposomes |
Sonabox acoustic enclosure | Misonix, Inc. | 432B | To make egg yolk liposomes |
1/8” tapered microtip | Misonix, Inc. | 419 | To make egg yolk liposomes |
Amber vials (4 ml, glass) | National Scientific | 13-425 | Lipid storage; includes vials, open-top caps, and cap septa |
Incu-Shaker Mini | Benchmark | 1222U12 | Incubated shaker for feeds |
BODIPY FL C16 | Thermo Fisher Scientific | D3821 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Hexadecanoic Acid) |
BODIPY FL C12 | Thermo Fisher Scientific | D3822 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid) |
BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D3834 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Pentanoic Acid) |
BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D2183 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionic Acid) |
TopFluor cholesterol | Avanti Polar Lipids Inc. | 810255 | Fluorescent lipid analog; 23-(dipyrrometheneboron difluoride)-24-norcholesterol |
Fatty acid-free BSA | Sigma-Aldrich | A0281-1G | For TopFluor cholesterol solubilization |
Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0387 | Mounting media for live larval imaging; 75 x 25 x 1 mm |
Low melt agarose | Thermo Fisher Scientific | BP165-25 | Mounting media for live larval imaging; 22 x 30 |
VWR microscope slides | VWR | 16004-422 | Mounting larvae for live imaging |
Coverslips | Cover Glass | 12-544A | Mounting larvae for live imaging |
Super glue | Loctite | LOC01-30379 | Mounting larvae for live imaging |
FluoroDish (glass bottom dish) | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | Mounting larvae for live imaging; 35 mm dish, 23 mm glass, 0.17 mm glass thickness |
Confocal microscope | Leica Microsytems | SP-2, SP-5 | Microscope for high magnification live imaging |
Stereoscope | Nikon | SM21500 | Microscope for low magnification live imaging |
Glass culture tubes | Kimble | 73500-13100 | Lipid extraction; (13 x 100 mm; 13 ml) |
Savant SpeedVac Plus | ThermoQuest | SC210A | Lipid extraction |
Channeled TLC plates | Whatman Scientific | WC4855-821 | Food intake assay; LK5D Silica Gel 150 A, 20 x 20 cm, 250 um thick; Discontinued |
Channeled TLC plates | Analtech, Inc. | 66911 | Food intake assay; Direct replacement for Whatman Scientific TLC plates |
Typhoon 9410 Variable Mode Imager | GE Healthcare | 9410 | Fluorescent plate reader for food intake assay |
ImageQuant software | GE Healthcare | 29000605 | Analysis of food intake assay |
5 3/4’ Wide bore, borosilicate disposable pasteur pipets | Kimble | 63A53WT | Transfering larvae |