Este protocolo / manuscrito descreve um processo simplificado para a produção de cápsulas exinas esporopolenina (segundos) a partir de esporos clavatum Lycopodium e para o carregamento de compostos hidrofílicos para estes segundos.
Microcápsulas derivados de esporos ou pólen à base de plantas fornecem uma plataforma robusta para uma gama diversificada de aplicações de microencapsulação. cápsulas esporopolenina exinas (segs) são obtidos quando os esporos ou pólen são processados de modo a remover o conteúdo sporoplasmic internos. As microcápsulas ocas resultantes exibem um elevado grau de uniformidade micromerítica e reter características microestruturais intrincados relacionados com as espécies de plantas particulares. Aqui, demonstramos um processo simplificado para a produção de s a partir de esporos clavatum Lycopodium e para o carregamento de compostos hidrofílicos para estes segundos. O actual procedimento de isolamento SEC foi optimizado recentemente para reduzir significativamente os requisitos de processamento que são convencionalmente utilizados no isolamento SEC, e para assegurar a produção de microcápsulas intactas. Natural L. clavatum esporos são desengordurado com acetona, tratou-se com ácido fosfórico, e extensivamente lavadas para remover sporoplasmiconteúdo c. Depois de desengorduramento acetona, um único passo de processamento usando 85% de ácido fosfórico tem sido demonstrado para remover todo o conteúdo sporoplasmic. Ao limitar o tempo de processamento ácido para 30 horas, é possível isolar SECs limpas e evitar SEC fractura, o que tem sido demonstrado que ocorre com o tempo de processamento prolongado. lavagem extensiva com água, ácidos diluídos, diluir bases e solventes garante que todos os materiais e produtos químicos resíduos sporoplasmic são adequadamente removidos. A técnica de carga de vácuo é utilizada para carregar uma proteína modelo (Albumina de Soro Bovino) como um composto representativo hidrofílico. carregamento de vácuo proporciona uma técnica simples para carregar vários compostos, sem a necessidade de solventes agressivos ou produtos químicos indesejáveis que são frequentemente necessários em outros protocolos de microencapsulação. Com base nestes protocolos de isolamento e de carregamento, segs proporcionar um material promissor para uso em uma grande variedade de aplicações de microencapsulação, tais como, agentes terapêuticos, alimentos, cosméticos, de cuidados pessoais e proddutos.
Existe um interesse significativo em cápsulas à base de plantas naturais, obtidos a partir de esporos de plantas e pólens para uso em aplicações de microencapsulação. 15/01 Na natureza, esporos e pólen proporcionar uma protecção para os materiais genéticos sensíveis contra condições ambientais adversas. A estrutura básica de esporos de plantas e do pólen compreende, tipicamente, uma camada de invólucro exterior (exina), uma camada de invólucro interior (intina), e o material citoplasmático interno. A exina é composta de um biopolímero quimicamente robusto 1,9,10,13,16 referido como esporopolenina eo intina é composta principalmente de materiais celulósicos. 16-18 cápsulas vazias podem ser isoladas por vários processos para a remoção de material de 7,9 citoplasmática , proteínas, e a camada intine. 2,12,16 Estas cápsulas exinas esporopolenina (segundos) fornecer uma alternativa atraente para encapsulantes sintéticos devido à sua distribuição de tamanho estreita e morfologia uniforme. 7,9,13,19,20 adesenvolvimento de processos padronizados para a obtenção de s a partir de várias espécies de plantas, tais como Licopódio clavatum, abre a possibilidade de uma vasta gama de aplicações de microencapsulação nos campos de entrega de drogas, alimentos, cosméticos e 6,10-13,21.
A fim de obter SECs, investigadores trataram primeiro os esporos e pólen com solventes orgânicos e submetida a refluxo em soluções alcalinas para remover o conteúdo citoplasmático. 22-25 No entanto, a estrutura da cápsula remanescente foi determinada para conter ainda o intina camada celulósica. A fim de eliminar isto, os investigadores exploraram a utilização do tratamento de hidrólise ácida prolongada utilizando ácido clorídrico, ácido sulfúrico quente, ou ácido fosfórico quente ao longo de vários dias, 22-25 com ácido fosfórico a tornar-se o método preferido de remoção intina SEC. 2 No entanto, em curso investigação ao longo dos anos tem mostrado que vários esporos e pólenes têm diferentes graus de resistência à dura me processarthods comumente usados. 26,27 Alguns esporos e pólenes são completamente degradada e perder toda a integridade estrutural em soluções alcalinas fortes, ou tornar-se fortemente danificada em soluções ácidas fortes. 16 A variabilidade na resposta SEC para condições de tratamento é devido a variações sutis na química estrutura e morfologia do material de exina esporopolenina exina entre espécies. 28 Devido à variabilidade na robustez de cápsulas exinas esporopolenina (segundos), é necessário optimizar as condições de processamento para cada espécie de esporos e pólen.
Esporos de plantas da espécie L. clavatum tornaram-se a única fonte mais amplamente estudado da SCEE. Propõe-se que isto é principalmente devido à sua ampla disponibilidade, baixo custo, monodispersity, robustez e química 9,29 Os esporos podem ser facilmente colhidas e conter conteúdo sporoplasmic sob a forma de agrupamentos de 1 -. 2 uM organelos celulares e biomolecules. 11 L. clavatum esporos foram usados como um lubrificante em pó natural, 30,31 base para cosméticos, 30 e 32-36 em fitoterapia para uma ampla gama de aplicações terapêuticas. O SCEE obtidos a partir de L. clavatum foram mostrados para ser mais resistente ao processamento de SECs de outras espécies de esporos e pólen. 2 Após o processamento, as SECs resultantes foram mostrados para manter suas estruturas microridge intrincados e alta uniformidade morfológica, proporcionando uma grande cavidade interna para encapsulamento. 7 estudos indicam que o L. SECs clavatum podem ser utilizados para a encapsulação de fármacos, vacinas, 10,13 11 proteínas, células, 8 7,14 óleos, 5-7,9 e suplementos alimentares. 5,15 observadas eficiências de carregamento SEC são relativamente elevadas em comparação com convencional materiais de encapsulamento. 7 Há também um certo número de benefícios relatadosSEC para encapsulação, tais como a capacidade de mascarar o gosto, 6,10 e para proporcionar um certo grau de protecção natural contra a oxidação. 12 Nos estudos existentes, o método de extracção mais utilizada SEC para L. clavatum baseia-se em quatro etapas principais. O primeiro passo é de refluxo do solvente em acetona durante até 12 h a 50 ° C para secar os esporos. 11 O segundo passo é a refluxo alcalina em hidróxido de potássio a 6% durante até 12 h a 120 ° C para remover citoplasmática e materiais proteicos. 11 Passo três é a refluxo ácido em ácido fosfórico a 85% durante 7 dias a 180 ° C para remover o material intina celulósico. 11 Passo quatro é um processo de lavagem exaustiva utilizando água, solventes, ácidos e bases para remover todo o material não-exina restante e resíduos químicos.
Os principais objetivos da extração SEC em relação a aplicações de encapsulamento são para produzir cápsulas que estão vazios de material citoplasmático, livre from proteínas potencialmente alergênicas, e morfologicamente intactos. 2,37 No entanto, do ponto de vista de produção industrial, também é importante considerar factores económicos e ambientais adicionais, tais como, a eficiência energética, a duração de produção, segurança e resíduos resultantes. No que se refere à eficiência de energia, ambas as altas temperaturas e tempos de processamento longos afecta os custos de produção, bem como o impacto ambiental. duração produção e tempo de resposta são factores-chave que influenciam a rentabilidade de processamento. Particularmente preocupante é que o processamento de ácido fosfórico de alta temperatura aumenta a questões de segurança e é conhecido por resultar em escamação corrosivo que leva a aumentos significativos na manutenção da infra-estrutura e atrasos em tempos de rotação lote 38-40. Sempre que possível, minimizando o número de passos necessários pode levar a redução significativa dos resíduos produzidos. No entanto, a normalmente utilizada processo de quatro passos de L. extração clavatum SEC tem simplesmente evolved de décadas de pesquisa e teve pouco otimização processo real. Recentemente, Mundargi et al., 41 fez uma contribuição significativa para os trabalhos em curso neste domínio, através da avaliação e otimização de uma das técnicas de extração SEC mais comumente reportados de forma sistemática.
Na primeira secção deste trabalho: desengorduramento de esporos é demonstrado utilizando processamento de acetona a 50 ° C durante 6 horas; sporoplasm procedimentos de remoção e intina são demonstradas utilizando processamento de ácido fosfórico a 85%, a 70 ° C durante 30 h; lavagem extensiva com água, solventes, ácido, e a base é utilizada para demonstrar a remoção de conteúdos sporoplasmic residuais; e SEC secagem é demonstrada utilizando secagem por convecção e vácuo secagem em estufa. Na terceira secção, SEC carregamento vácuo é demonstrada utilizando o carregamento de vácuo de um modelo de proteína, albumina de soro bovino (BSA), seguido de BSA-carregado-SEC lavagem e liofilização. Na quarta seção, a determinção da eficiência de encapsulamento de BSA é demonstrada utilizando centrifugação, a sonda de ultra-sons, e espectrometria de UV / Vis.
Neste trabalho, uma análise sistemática da extração SEC de L. esporos clavatum é apresentada e este relatório mostra que é possível produzir cápsulas de qualidade superiores, ao mesmo tempo alcançar uma simplificação significativa do pré-existente protocolo vulgarmente usado. 11 Em contraste com o protocolo já existente que requer uma temperatura elevada de processo (180 ° C) e uma longa duração do processo (7 dias), a corrente 11 SEC optimização processamento e…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the National Research Foundation (NRF-NRFF2011-01) and the National Medical Research Council (NMRC/CBRG/0005/2012).
Lycopodium clavatum spores (s-type) | Sigma | 19108-500G-F | |
Bovine serum albumin | Sigma | A2153-50G | |
FITC-conjugated BSA | Sigma | A9771-250MG | |
Phosphoric acid (85 % w/v) | Sigma | 438081-2.5L | |
Hydrochloric acid | Sigma | V800202 | |
Sodium hydroxide | Sigma | S5881-1KG | |
Acetone | Sigma | V800022 | |
Ethanol | AcME | C000356 | |
Deionized water | Millipore purified water | ||
Qualitative filter paper (grade No. 1, cotton cellulose) | |||
Polystyrene microspheres (50 ± 1 µm) | Thermoscientific (CA, USA) | 4250A | |
Vectashield | Vector labs (CA, USA) | H-1000 | |
Sticky-slides, D 263 M Schott glass, No.1.5H (170 μm, 25 mm x 75 mm) unsterile glass slide | Ibidi GmbH (Munich, Germany) | 10812 | |
Commercial Lycopodium SECs (L-type) | Polysciences, Inc. (PA, USA) | 16867-1 | |
Heating plates | IKA, Germany | ||
Scanning electron microscope | Jeol, Japan | JFC-1600 | |
Elemental analyzer | Elementar, Germany | VarioEL III | |
FlowCam: The benchtop system | Fluid Imaging Technologies, USA | FlowCamVS | |
Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss, Germany | LSM710 | |
Freeze dryer | Labconco, USA | ||
UV Spectrometer | Boeco, Germany | S220 |