Mass histologie à Quantifier neurodégénérescence<em> Drosophila</em

Summary

Drosophile est largement utilisé en tant que système modèle pour étudier la neurodégénérescence. Ce protocole décrit un procédé par lequel une dégénérescence, comme déterminé par la formation de vacuoles dans le cerveau, peuvent être quantifiés. Il minimise également les effets dus à la procédure expérimentale par le traitement et le contrôle sectionner et les mouches expérimentales comme un échantillon.

Abstract

maladies progressives neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer (AD) ou la maladie de Parkinson (PD) sont une menace croissante pour la santé humaine dans le monde entier. Bien que les modèles de mammifères ont fourni des informations importantes sur les mécanismes sous-jacents de la pathogénicité, la complexité des systèmes de mammifères ainsi que leurs coûts élevés limitent leur utilisation. Par conséquent, le modèle système Drosophila simple mais bien établie offre une alternative pour étudier les voies moléculaires qui sont affectés dans ces maladies. Outre les déficits comportementaux, les maladies neurodégénératives sont caractérisées par des phénotypes histologiques tels que la mort neuronale et axonopathy. Pour quantifier la dégénérescence neuronale et de déterminer comment elle est affectée par des facteurs génétiques et environnementaux, nous utilisons une approche histologique qui est basé sur la mesure des vacuoles dans le cerveau des mouches adultes. Pour minimiser les effets de l'erreur systématique et de comparer directement les sections de contrôle et expmouches erimental dans une préparation, nous utilisons la méthode du «col» pour des coupes en paraffine. La neurodégénérescence est ensuite évaluée par la mesure de la taille et / ou le nombre de vacuoles qui se sont développées dans le cerveau de mouche. Cela peut être fait en se concentrant sur une région d'intérêt spécifique ou en analysant l'ensemble du cerveau en obtenant des coupes en série qui couvrent la tête complète. Par conséquent, cette méthode permet de mesurer non seulement la dégénérescence sévère, mais aussi des phénotypes relativement douces qui ne sont détectables que dans quelques sections, comme cela se produit au cours du vieillissement normal.

Introduction

Avec l'augmentation de l'espérance de vie, les maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer ou de Parkinson sont devenus une menace pour la santé de plus en plus pour la population générale. Selon les instituts nationaux de la santé, 115 millions de personnes dans le monde sont prévus d'être affectées par la démence en 2050. Bien que des progrès significatifs ont été réalisés dans l'identification des gènes et des facteurs de risque impliqués dans au moins certaines de ces maladies, pour beaucoup d'entre eux, le sous-jacent mécanismes moléculaires sont encore inconnus ou mal compris.

Organismes modèles invertébrés simples comme Caenorhabditis elegans et Drosophila melanogaster offrent une variété d'avantages expérimentaux pour étudier les mécanismes des maladies neurodégénératives, y compris un cycle court de la vie, un grand nombre de descendants, et la disponibilité des méthodes génétiques et moléculaires bien établies et parfois uniques ^{1 -12.} En outre, ces organismes se prêtent à impartialeécrans d'interaction qui permettent d'identifier les facteurs qui contribuent à ces maladies par leurs effets aggravants ou améliorer sur phénotypes neurodégénératives.

L'analyse de ces interactions génétiques et évaluer les effets du vieillissement nécessite des protocoles quantitatifs pour détecter la neurodégénérescence et de mesurer sa gravité. Cette évaluation peut se faire relativement facilement lorsque l'on mesure les aspects comportementaux chez la drosophile, tels que l' apprentissage olfactif, géotaxie négative, ou phototaxie rapide, qui fournissent une valeur de performance numérique ^13-21. Il est également possible de déterminer les effets sur la survie neuronale en comptant les neurones. Cependant, ceci est seulement possible lorsqu'on se concentre sur une population spécifique qui est clairement identifiable, comme les neurones dopaminergiques qui sont affectés dans la MP, et même alors, les résultats ont été controversés ^22-24.

Le protocole décrit ici utilise la méthode du collier pour effectuer des coupes en série de paraffine, un procédéqui a été à l' origine développé par Heisenberg et Böhl, qui sert à isoler des mutants du cerveau anatomiques chez la drosophile ^25. L'utilisation de la méthode du collier a été ensuite adapté, y compris dans cryocoupes, vibratome sections, et les sections en plastique ^26-28. Ici, cette méthode est utilisée pour obtenir des coupes en série de la tête de la mouche entière, qui peut ensuite être utilisé pour mesurer les vacuoles qui se développent dans les mouches avec des phénotypes neurodégénératives ^16,21,29-32. Ces mesures peuvent être effectuées dans des zones spécifiques du cerveau ou peuvent couvrir l'ensemble du cerveau; cette dernière approche permet d'identifier même faibles phénotypes dégénératives, comme observé au cours du vieillissement. Enfin, lors de l'utilisation des colliers, jusqu'à 20 mouches peuvent être traités comme une préparation, ce qui est non seulement moins de temps, mais permet également à l'analyse de contrôle et les mouches expérimentales dans la même préparation, en minimisant les artefacts dus à de légers changements dans la préparation.

Protocol

1. Fixation de la tête sur les colliers et incorporation dans la paraffine Note: Toutes les étapes du processus de fixation doit être fait dans une hotte. Méthylbenzoate, tout en ne posant un risque pour la santé, a une odeur très distincte, ce qui peut être écrasante en cas de manipulation dans une hotte. Avant anesthésier les mouches, forment 50 ml de solution Carnoy en ajoutant 15 ml de chloroforme et 5 ml d'acide acétique glacial à 30 ml d'éthanol à 99% (ne pas mélanger le ch…

Representative Results

En utilisant les résultats de la méthode décrite dans les sections en série colorées par le pigment de l' œil 33 qui englobent la tête de la mouche entière. Une partie de ceci est montré à la figure 1B, où les sections à partir d' une tête individuelle sont présentés de haut en bas. Les sections de différentes mouches sont vu de gauche à droite dans cet exemple. Pour faciliter l' orientation et l' identification des mouches, un…

Discussion

Le procédé décrit fournit un moyen pour quantifier la neurodégénérescence dans le cerveau de la drosophile. Alors que d'autres méthodes, telles que le comptage d'un type de cellule spécifique, peuvent être utilisées pour identifier la neurodégénérescence, l'avantage de cette méthode est qu'elle peut être appliquée de façon plus générale. Le comptage des cellules exige que ces cellules puissent être identifiées de façon fiable en utilisant soit un anticorps spécifique ou l&…

Materials

Name of the Reagent/Equipment	Company	Catalog Number
Collar	Genesee Scientific	TS 48-100	We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee. A discription to make collars can be found at http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html
Rubber ice cube tray for embedding	Household store		The size can be made to fit by glueing in additional walls
Crystallizing dish	Fisher Scientific company	08-762-3
Ether	Fisher Scientific Company	E138-1
Ethanol	Decon Laboratories Inc.	2701
Choloroform	Fisher Scientific Company	C298-500
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific Company	A38-212
Methylbenzoate	Fisher Scientific Company	M205-500	Distinct Odor
Use in fume hood
Low Melting Point Paraffin Wax	Fisher Scientific Company	T565	Make sure to keep extra melted in a 65°C waterbath
Microtome	Leica Biosystems	Reichert Jung 2040 Autocut
Microscope Slide	Fisher Scientific Company	12-550D
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific Company	12-545-M
SafeClear	Fisher Scientific Company	314-629	Three different containers for washes
Vertical Staining Jar with Cover	Ted Pella Inc.	432-1
Permount	Fisher Scientific Company	SP15-500
Poly-L-lysine Solution	Sigma Life Science	P8290-500