Visualizando os Efeitos de escarro no desenvolvimento de biofilmes usando um modelo Chambered lamela
Summary
This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.
Abstract
Os biofilmes consistem de grupos de bactérias embebidas em uma matriz auto-secretado. Eles desempenham um papel importante na contaminação industrial, bem como no desenvolvimento e persistência de muitas infecções relacionadas com a saúde. Um dos biofilmes mais bem descrita e estudada em doenças humanas ocorre na infecção pulmonar crónica de pacientes com fibrose cística. Ao estudar biofilmes no contexto do hospedeiro, muitos factores que podem influenciar a formação e desenvolvimento de biofilme. A fim de identificar como factores do hospedeiro pode afetar a formação de biofilme e desenvolvimento, foi utilizado um método lamela chambered estática para crescer biofilmes na presença de fatores derivados do hospedeiro na forma de sobrenadantes de escarro. As bactérias são semeadas em câmaras e expostos a filtrados de expectoração. Na sequência de 48 horas de crescimento, os biofilmes estão manchadas com um kit de viabilidade de biofilme comercial antes da microscopia confocal e análise. Após a aquisição das imagens, as propriedades do biofilme pode ser avaliada através de diferentes plataformas de software.Este método nos permite visualizar as propriedades fundamentais do crescimento do biofilme na presença de diferentes substâncias, incluindo antibióticos.
Introduction
biofilmes bacterianas são grupos de microrganismos que estão ligados uns aos outros e incorporados numa matriz auto-secretado. 1,2 Classicamente, eles representam bactérias fisicamente ligados a uma superfície abiótica ou biótico formado sob condições de fluxo. Os biofilmes também têm sido mostrados para crescer em condições estáticas (ausência de fluxo) e distal de superfícies, tais como na interface ar-líquido de piscinas termais ou películas formadas nos tubos de ensaio. Estes biofilmes têm sido reconhecidos no meio ambiente e são um grande prejuízo para processos industriais, como eles podem se formar em reservatórios de água ou em tubos, resultando em biofouling, corrosão e entupimentos. 3,4
Os biofilmes também são críticas em ambientes de cuidados de saúde, como têm sido mostrado estar envolvidas em infecções relacionadas com cateteres, infecções pulmonares em doentes com fibrose cística, bem como em numerosas outras infecções. 5,6 Uma das marcas de infecções biofilme é a devincado susceptibilidade das bactérias aos antibióticos e auditivos depuração pelo sistema imune inato. 7-9 O mais bem estudadas, cenários clinicamente relevantes envolvendo infecção baseada biofilme ocorre em pacientes com fibrose cística (FC), que estão cronicamente infectados com biofilmes de Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa podem ser submetidos a uma série de alterações durante o estabelecimento da infecção crónica que tornam muito difíceis de tratar. 10,11 biofilmes pode diferencialmente ativar a imunidade inata e conduzir a inflamação. 12-14 Como estas infecções levar ao aumento da morbidade e mortalidade em pacientes com FC, é crucial para entender fatores que podem afetar o desenvolvimento do biofilme neste contexto.
Um estudo recente sugere que hospedeiras-factores são importantes na formação de agregados de biofilme de P. aeruginosa. 15 Estes biofilmes contribuir para a redução da susceptibilidade aos antibióticos e os mecanismos de defesa do hospedeiro. o preseNCE de factores derivados do hospedeiro, tais como a elastase de neutrófilos, assim como produtos secretados a partir de microrganismos presentes no pulmão CF, tem o potencial de modular significativamente a formação de biofilme e de desenvolvimento. 16 Além disso, os biofilmes interagir com o hospedeiro para modular a expressão de numerosos caminhos e iniciar a inflamação. Enquanto os métodos de alto rendimento, tal como o ensaio de violeta de cristal padrão, podem fornecer alguma informação no que diz respeito ao processo de biofilme, a visualização do biofilme em resposta a estes factores proporcionam mais informação em profundidade.
Nesse artigo, nós descrevemos um método para a utilização de factores de expectoração de pacientes com FC para estudar o desenvolvimento de biofilmes in vitro. Este método permite a rápida visualização de biofilme expostos a expectoração contendo factores do hospedeiro, utilizando um kit comercial viabilidade do biofilme. Esta técnica pode ser usada para identificar visualmente as alterações que ocorrem durante o crescimento de biofilme, na presença de exógenonos produtos, e representa um método melhorado para analisar as alterações no desenvolvimento de biofilme sob várias condições.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os métodos aqui descritos permitem a visualização de biofilmes bacterianas cultivadas na presença de produtos exógenos. Não surpreendentemente, a produção dos exoproducts é de importância quando se utiliza este tipo de sistema. Por exemplo, ditiotreitol (DTT), é frequentemente utilizado em amostras de saliva humana para ajudar a liquefazer as amostras. No entanto, o efeito do DTT sozinho pode diminuir o desenvolvimento do biofilme e a viabilidade (dados não mostrados). Assim, controles adequados para todas a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TB reconhece uma bolsa de pesquisa da Fibrose Cística no Canadá.
Materials
| Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well | Thermo Sicher Scientific | 155409 | |
| Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit | Thermo Fisher Scientific | L10316 | |
| Blood agar plates | Thermo Fisher Scientific | R10215 | Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation |
| COMSTAT | Availble software online | COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk | |
| Millers LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 12780-052 | Standard media for overnight gowth/biofilm growth |
| Millex-GV Syringe Filters | Millipore | SLGV013SL | Filtering of sputum supernants |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | Oxoid | BR0014G | Washing of biofilm chambers after media removal |
| Zeiss AxioVert 200M | Carl Zeiss | ||
| Hamamatsu C9100-13 EM-CCD | QS Technologies Inc. | ||
| Spectral Borealis | Qs Technologies Inc. | ||
| Perkin Elmer Volocity | QS Technologies Inc. | Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf |
References
- Beaudoin, T., Waters, V. Infections with biofilm formation: selection of antimicrobials and role of prolonged antibiotic therapy. Pediatr.Infect.Dis.J. , (2016).
- Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerg.Infect.Dis. 8 (9), 881-890 (2002).
- Hobley, L., Harkins, C., MacPhee, C. E., Stanley-Wall, N. R. Giving structure to the biofilm matrix: an overview of individual strategies and emerging common themes. FEMS Microbiol.Rev. 39 (5), 649-669 (2015).
- Katharios-Lanwermeyer, S., Xi, C., Jakubovics, N. S., Rickard, A. H. Mini-review: Microbial coaggregation: ubiquity and implications for biofilm development. Biofouling. 30 (10), 1235-1251 (2014).
- Donlan, R. M. Biofilm formation: a clinically relevant microbiological process. Clin.Infect.Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).
- Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends Microbiol. 21 (9), 466-474 (2013).
- Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O’Toole, G. A. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).
- Mah, T. F. Biofilm-specific antibiotic resistance. Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).
- Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. The biofilm-specific antibiotic resistance gene ndvB is important for expression of ethanol oxidation genes in Pseudomonas aeruginosa biofilms. J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).
- Beaudoin, T., Aaron, S. D., Giesbrecht-Lewis, T., Vandemheen, K., Mah, T. F. Characterization of clonal strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from cystic fibrosis patients in Ontario, Canada. Can. J. Microbiol. 56 (7), 548-557 (2010).
- Vidya, P., et al. Chronic infection phenotypes of Pseudomonas aeruginosa are associated with failure of eradication in children with cystic fibrosis. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. , (2015).
- Beaudoin, T., Lafayette, S., Nguyen, D., Rousseau, S. Mucoid Pseudomonas aeruginosa caused by mucA mutations result in activation of TLR2 in addition to TLR5 in airway epithelial cells. Biochem.Biophys.Res.Commun. 428 (1), 150-154 (2012).
- Beaudoin, T., et al. The level of p38alpha mitogen-activated protein kinase activation in airway epithelial cells determines the onset of innate immune responses to planktonic and biofilm Pseudomonas aeruginosa. J.Infect.Dis. 207 (10), 1544-1555 (2013).
- LaFayette, S. L., et al. Cystic fibrosis-adapted quorum sensing mutants cause hyperinflammatory responses. Sci.Adv. 1 (6), e1500199 (2015).
- Staudinger, B. J., et al. Conditions associated with the cystic fibrosis defect promote chronic Pseudomonas aeruginosa infection. Am.J.Respir.Crit.Care Med. 189 (7), 812-824 (2014).
- Kennedy, S., et al. Activity of Tobramycin against Cystic Fibrosis Isolates of Burkholderia cepacia Complex Grown as Biofilms. Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 348-355 (2015).
- Tom, S. K., Yau, Y. C., Beaudoin, T., LiPuma, J. J., Waters, V. Effect of High-Dose Antimicrobials on Biofilm Growth of Achromobacter Species Isolated from Cystic Fibrosis Patients. Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 650-652 (2015).
- Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).
- Vorregaard, M. . Informatics and Mathematical Modelling. , (2008).
- Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide. J. Vis. Exp. (47), e2481 (2011).
