El examen de la Asamblea proteasoma con recombinante arqueano Proteasomas y desnaturalizante PÁGINA: El Caso de un enfoque combinado
Summary
Este protocolo utiliza tanto la co-expresión de subunidades y de mezcla para un examen más a fondo de ensamblaje proteasoma subunidad recombinante postlysis.
Abstract
Proteasomas se encuentran en todos los ámbitos de la vida. Ellos proporcionan la principal vía de degradación de proteínas intracelulares en las células eucariotas, aunque su montaje no se conoce completamente. Todos los proteasomas contienen una partícula estructuralmente conservadas núcleo (CP), o proteasoma 20S, que contiene dos anillos de subunidades beta heptameric emparedadas entre dos anillos α subunidad heptameric. Archaeal proteasomas 20S son de composición más simple en comparación con sus homólogos eucariotas, sin embargo, que ambos comparten un mecanismo de montaje común. En consecuencia, arqueas proteasomas 20S siguen siendo modelos importantes para el montaje del proteasoma eucariota. En concreto, la expresión recombinante de 20S arqueas proteasomas junto con electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante (PAGE) ha dado muchas pistas importantes sobre la biogénesis del proteasoma. A continuación, se discute un medio para mejorar la estrategia habitual de la co-expresión de α del proteasoma arqueas y las subunidades ß antes de nondenaturiPÁGINA ng. Se demuestra que a pesar de la rápida y eficiente, un enfoque coexpresión solo puede faltar montaje intermedios clave. En el caso de la proteasoma, la coexpresión no puede permitir la detección de la media-proteasoma, una que contiene una α-anillo completo intermedia y una β-anillo completo. Sin embargo, este intermedio se detecta fácilmente mediante la mezcla de lisado. Sugerimos que la combinación de co-expresión con mezcla lisado se obtiene un enfoque que es más profundo en el análisis de montaje, sin embargo, sigue siendo no intensiva de trabajo. Este enfoque puede ser útil para el estudio de otros complejos multiproteicos recombinantes.
Introduction
Complejos multiproteicos llevan a cabo numerosas actividades celulares críticas 1. Para muchos de estos complejos, se sabe mucho más acerca de su estructura y la función de aproximadamente el 2,3 de su montaje. El proteasoma es uno tan complejo y se encuentra en todos los ámbitos de la vida. En eucariotas, esta máquina molecular está en el núcleo del sistema de proteasoma / ubiquitina (UPS) y proporciona la principal vía de degradación de proteínas intracelulares 4. El proteasoma eucariota (referido como el proteasoma 26S) se compone de dos conjuntos principales sub: un proteasoma 20S, o núcleo de la partícula (CP) 5, que puede ser un tope en uno o ambos extremos por una partícula de regulación de 19S (RP) 6.
El proteasoma 20S es un gran proteasa compartimentada. Su estructura cuaternaria se conserva absolutamente en todos los dominios de la vida y consiste en una pila de cuatro ciclos de siete miembros que contienen dos tipos de subunidades relacionadas estructuralmente, α; y ß 5,7,8. En eucariotas, los dos anillos exteriores están cada uno compuesto de siete subunidades alfa diferentes y los dos anillos interiores están cada uno compuesto de siete subunidades beta distintas; actividad proteolítica reside dentro de tres de las subunidades beta. Por el contrario, los anillos Cp de arqueas y bacterias normalmente se componen de un solo tipo de α y un tipo de subunidad β. Proteasomas arqueas han proporcionado un importante sistema modelo para estudiar el montaje del proteasoma tanto por su simplicidad compositiva y su compartir un mecanismo de ensamblaje común con sus homólogos eucariotas 9-13. En breve, las subunidades alfa ensamblan en anillos alfa primero, que sirven como un andamio sobre el que beta subunidades de montar. Las medias proteasomas resultantes (α 7 β 7) dimerize, dando lugar a ensamblados completamente CP (α β 7 7 7 β α 7). Durante la dimerización, los propéptidos presentan en subunidades ßse eliminan autocatalítica, la exposición de las treoninas N-terminales catalíticos. El uso de proteasomas arqueas para modelar ensamblaje tiene con frecuencia las ventajas de la producción de proteínas recombinantes del proteasoma archaea en Escherichia coli. Este es un enfoque valioso porque permite a las subunidades que se producen en diversas combinaciones, ya que ambos WT y versiones mutantes, en un organismo huésped que no produce sus propios proteasomas.
El control de la asamblea de varios complejos de proteínas bioquímicamente requiere algún tipo de método de fraccionamiento que separa los complejos totalmente ensamblados de montaje intermedios y precursores. Debido a su capacidad de resolver superior, no desnaturalizante de poliacrilamida electroforesis en gel (PAGE) ha demostrado ser especialmente útil en el fraccionamiento de diversos grandes complejos multiproteicos 14-17. La combinación de la producción del proteasoma arqueas recombinante y PÁGINA desnaturalizante se ha convertido en un poderoso enfoque en dissecting ensamblaje proteasoma 9,11,12,18. Sin embargo, el método habitual por la que se aplica este enfoque (es decir. A través de la co-expresión recombinante de subunidades alfa y beta) tiene un inconveniente importante. Las reacciones de ensamblaje son cooperativas y fuertemente dependiente de la concentración 3. Dado que la concentración de proteínas dentro de las células es muy alta 19, debido a los efectos de volumen excluidos, reacciones de montaje se efectúen rápidamente in vivo. Por lo tanto es posible que se pierda importantes intermedios de montaje cuando se coexpresan alfa y beta subunidades.
Aquí, argumentamos a favor de un enfoque combinado en el estudio del conjunto de proteasoma utilizando subunidades del proteasoma arqueas recombinantes. En este enfoque, se emplean dos métodos de mezcla coexpression y lisado. El primero permite el análisis rápido de montaje debido a la coexpresión es menos mano de obra. Esta última depende de la expresión separada de alfa y beta subunidades, seguido de mezcla. Aunque este requires un poco más esfuerzo que la co-expresión, es más que compensada por la capacidad de detectar intermedios que se pierden durante la co-expresión. Juntos, estos dos métodos pueden proporcionar una imagen más completa del conjunto del proteasoma.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se demuestra el beneficio de un enfoque combinado para analizar el montaje del proteosoma por nondenaturing PAGE utilizando proteasomas arqueas recombinantes. El método usual de 9,11 coexpresión bacteriana de subunidades del proteasoma permite el análisis rápido, pero puede no revelar montaje intermedios clave. Se aconseja la combinación de co-expresión con lisado de mezcla para desarrollar una visión más amplia de montaje de eventos.
La ventaja de este enfoque combinado e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención de apoyo Fondos de Investigación (RSFG) de la Universidad de Indiana-Purdue University, Indianapolis, y en parte por un premio de la Asociación Americana del Corazón 14GRNT20390154, a ARCA
Materials
| Acrylamide (40%) solution | Biorad | 1610104 | Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective equipment |
| Amicon ultra 0.5ml centrifugal filters | EMDMillipore | UFC501024 | |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| BCA assay kit | Pierce | 23225 | |
| Bisacrylamide (2%) solution | Biorad | 1610142 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172 | |
| E.coli BL21 competent cells | EMD Millipore | 69450 | |
| GelCode Blue | Thermo Fisher | 24592 | Colloidal coomassie stain reagent for gels |
| Gel doc EZ system | Biorad | 1708270 | Gel documentation system |
| Gel releasers | Biorad | 1653320 | Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid. |
| Glass rod | Thermo Fisher | 11-380B | |
| Glycerol | Sigma | 49767 | |
| Glycine | Thermo Fisher | BP3865 | |
| Hamilton syringe | Thermo Fisher | 14-813-38 | Glass syringe for loading gels |
| HEPES | US Biologicals | H2010 | |
| HMW Native calibration kit | GE Healthcare | 170445-01 | High molecular weight protein standards |
| Hoefer SG30 | Thermo Fisher | 03-500-277 | Gradient maker |
| Imidazole | US Biologicals | 280671 | |
| IPTG | US Biologicals | I8500 | For induction of protein expression |
| Isopropanol | Thermo Fisher | BP26181 | |
| Kanamycin sulfate | US Biologicals | K0010 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| MgCl2 | Fluka analytical | 630680 | |
| Mini Protean Tetra Cell | Biorad | 1658002EDU | Gel electrophoresis apparatus |
| NaCl | Thermo Fisher | S640-3 | |
| NaOH | Thermo Fisher | S318-1 | |
| Pefabloc SC | Roche | 11429876001 | Protease inhibitor |
| pET42 | EMD Millipore | 70562 | Expression plasmid |
| Precision plus all blue standard | Biorad | 1610373 | Molecular protein standard for SDS-PAGE |
| Quickchange mutagenesis kit | Agilent technologies | 200521 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher | BP166 | |
| Suc-LLVY-AMC | Enzo lifesciences | BML P802-0005 | Fluorogenic substrate |
| Talon Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | Immobilized-cobalt affinity resin |
| TEMED | Sigma | T7024 | |
| Tris | US Biologicals | T8600 | |
| Triton-X100 | Sigma | 93426 | |
| Tryptone | Bacto BD | 211699 | |
| UV sample tray | Biorad | 1708271 | For UV imaging of gels |
| Yeast extract | Bacto BD | 212720 |
References
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