효율적이고 사이트 별 스트레인 승진 아 지드 - 알킨 사이클로에 의해 항체 라벨링
Summary
Here, we present a protocol to site-specifically introduce chemical probes into an antibody fragment by genetically incorporating an azide-containing amino acid, and subsequently coupling the azide with a chemical probe by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC).
Abstract
그들의 구조와 기능을 연구하는 단백질로 화학 프로브를 소개 할 수 현재 많은 화학 도구가 있습니다. 유용한 방법은 유 전적으로 bioorthogonal 관능기를 함유하는 천연 아미노산을 도입하여 단백질 결합이다. 이 보고서는 사이트 별 항체 결합에 대한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜은 아 지드 – 함유 아미노산의 유전자 도입하고, 변형 촉진 지드 – 사이클로 알킨 (SPAAC)에 의한 접합 반응의 실험 세부 사항을 포함한다. 이 변형 촉진 반응은 생리적 pH와 온도에서 반응 분자의 단순한 혼합으로 진행하고, 구리 (I) 이온 및 구리 킬레이트 배위자와 같은 추가의 시약을 필요로하지 않는다. 따라서,이 방법은 일반적으로 단백질 결합 항체 약물 접합체 (ADC)는 개발에 유용 할 것입니다.
Introduction
대장균에서 P는 -methoxyphenylalanine의 유전 적 결합이보고 된 이후, 한 100 개 이상의 비 천연 아미노산 (UAAs가) 성공적으로 다양한 단백질에 통합되었습니다. 이들 중에서도 UAAs 1-3 bioorthogonal 관능기를 함유하는 아미노산은 광범위하게 연구하고, 최대 비율을 표현하고있다. UAAs에 사용되는 bioorthogonal 기능 그룹은 케톤, 4 지드, 5 알킨, 6 cyclooctyne, 7 테트라, 8 α, β 불포화 아미드, 9 노보 넨, 10 transcyclooctene, 11, 시클로 [6.1.0] -nonyne을 포함한다. 각 작용기는 장점과 단점이 있지만 (11), 아 지드 – 함유 아미노산이 가장 광범위 단백질 접합에 사용되어왔다. P -Azidophenylalanine (AF), 아지도 – 함유 아미노산 중 하나가 용이 가능하며, 그 혼입 efficiency이 우수합니다. 이 아미노산을 함유하는 변이체 단백질은 구리 촉매 고리 화하거나 SPAAC 의해 cyclooctynes 알킨과 반응 할 수있다. 12-20
최근 바이오 제약 산업에서 큰 관심을 받고있다. 항체 약물 접합체 (ADC)는 의한 인간 암 (21) 및 치료 대상 치료 능력에 유리한 치료 항체의 클래스 기타 질병. 50 개 이상의 ADC는 임상 시험에서 현재 및 수는 급속히 증가하고있다. ADC 제품 개발에 많은 요인 효과를 최대화하고 부작용을 최소화하기 위해 고려되어야한다. 이러한 요인 중 효율적이고 부위 특이 적 결합 반응은 항체와 공유 결합을 형성하고, 약물은 매우 중요하다. 공액 반응에 원하는 효율 및 특이성은 bioorthogonal에서 작용기와 결합함으로써 달성 될 수있다특이 항체로 혼입되는 비 천연 아미노산. 여기에 22 ~ 26, 우리에 대한 프로토콜을보고 사이트를-구체적으로 통합 항체 단편으로 AF 및 생화학 프로브 변이체 항체 단편 공역.
Protocol
1. 플라스미드 건설 그의 6 -tag와 대상 항체 유전자 (pBAD-HerFab-WT)을 표현하는 것 발현 플라스미드 (pBAD-HerFab – L177TAG)를 구축하고, 앰버 코돈과 류신-177의 코돈을 대체 (TAG) 27 사용 종래의 부위 특이 적 변이 법. 재료의 표를 참조하십시오. 진화의 tRNA 티르와 아미노 아실 tRNA의 합성 (Aars의) 한 쌍의 유전자를 포함하는 또 다른 발현 플라스미드 …
Representative Results
이 연구에서, 항체 단편은 부위 – 특이 적 단편에 아 지드 – 함유 아미노산을 도입하고, 변형 cyclooctyne로 돌연변이 된 항체 단편을 반응시켜 형광 물질과 결합 (도 1)이었다. HerFab은 AF가 지드 – 함유 아미노산으로 통합되었다하는 대상 항체 단편으로서 선택 하였다. AF로 교체 HerFab 잔사를 선택하려면 HerFab의 X 선 결정 구조 분석 하였다. 잔류 물을 30 …
Discussion
단백질에 비 천연 아미노산의 유전 결합 단백질 변성에 사용되는 다른 방법에 비해 여러 가지 장점을 갖는다. 중요한 장점 중 1-3 하나는 단백질의 종류는 일반적으로 적용됩니다. 원칙적으로, 표적 단백질 및 단백질의 표적 부위를 선택에는 제한이 없다. 그러나 UAA와 구조적 또는 기능적으로 중요한 잔기의 치환은 목적 단백질의 구조와 기능을 변화 될 수있다. 일반적으로, 용매에 노출되…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| 1. plasmid Construction | |||
| plasmid pBAD_HerFab_L177TAG | optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015) | ||
| plasmid pEvol-AFRS | Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) | ||
| DH10B | Invitrogen | C6400-03 | Expression Host |
| Plasmid Mini-prep kit | Nucleogen | 5112 | 200/pack |
| Agarose | Intron biotechnology | 32034 | 500g |
| Ethidium bromide | Alfa Aesar | L07482 | 1g |
| LB Broth | BD Difco | 244620 | 500g |
| 2. Culture preparation | |||
| 2.1) Electroporation | |||
| Micro pulser | BIO-RAD | 165-2100 | |
| Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2089 | 0.1cm electrode gap, pkg. of 50 |
| Ampicillin Sodium | Wako | 018-10372 | 25g |
| Chloramphenicol | Alfa Aesar | B20841 | 25g |
| Agar | SAMCHUN | 214230 | 500g |
| SOC medium | Sigma | S1797 | 100ML |
| 3. Expression and purification of HerFab-L177AF | |||
| 3.1 Expression of Herfab-L177AF | |||
| p-azido-L-phenylalanine (AF) | Bachem | F-3075.0001 | 1g |
| L(+)-Arabinose, 99% | Acros | 104981000 | 100g |
| Hydrochloric acid, 35~37% | SAMCHUN | H0256 | 500ml |
| 3.2 Cell lysis | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% | SAMCHUN | T1351 | 500g |
| EDTA disodium salt dihydrate, 99.5% | SAMCHUN | E0064 | 1kg |
| Sucrose | Sigma | S9378 | 500g |
| Lysozyme | Siyaku | 126-0671 | 1g |
| 3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography | |||
| Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | 25ml |
| Polypropylene column | QIAGEN | 34924 | 50/pack, 1ml capacity |
| Imidazole, 99% | SAMCHUN | I0578 | 1kg |
| Sodium phosphate monobasic, 98% | SAMCHUN | S0919 | 1kg |
| Sodium Chloride, 99% | SAMCHUN | S2907 | 1kg |
| 4. Conjugation of Purified HerFab-L177AF with Alkyne Probes Using Strain-Promoted Azide-Alkyne Cycloaddition (SPAAC) | |||
| Cy5.5-ADIBO | FutureChem | FC-6119 | 1mg |
| 5. Purification of Labeled HerFab | |||
| Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters | MILLIPORE | UFC500396 | 96/pack, 500ul capacity |
| 6. SDS-PAGE Analysis of Labeled HerFab and Fluorescent Gel Scanning | |||
| 1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 % | Sigma | 10708984001 | 10g |
| NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X | Thermofisher | NP0007 | 10ml |
| MES running buffer | Thermofisher | NP0002 | 500ml |
| Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels | Thermofisher | NO0321 | 12well |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Wako | 031-17922 | 25g |
| Typhoon 9210 variable mode imager | Amersham Biosciences |
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Cite This Article
Kim, S., Ko, W., Park, H., Lee, H. S. Efficient and Site-specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition. J. Vis. Exp. (118), e54922, doi:10.3791/54922 (2016).