Induire ischémie-reperfusion chez la souris Ear Skin pour Intravitale multiphotonique Imaging des réponses immunitaires
Summary
Ce protocole décrit l'induction d'un modèle d'ischémie-reperfusion (IR) sur la peau de l'oreille de la souris utilisant un aimant de serrage. En utilisant un modèle d'imagerie intravitale sur mesure, nous étudions dans les réponses inflammatoires in vivo post-reperfusion. La raison derrière le développement de cette technique est d'étendre la compréhension de la façon dont les leucocytes réagissent aux blessures IR de la peau.
Abstract
Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent re-oxygenation of the tissues (reperfusion). In the skin, ischemia-reperfusion (IR) is the main contributing factor to the pathophysiology of pressure ulcers. While the cascade of events leading up to the inflammatory response has been well studied, the spatial and temporal responses of the different subsets of immune cells to an IR injury are not well understood. Existing models of IR using the clamping technique on the skin flank are highly invasive and unsuitable for studying immune responses to injury, while similar non-invasive magnet clamping studies in the skin flank are less-than-ideal for intravital imaging studies. In this protocol, we describe a robust model of non-invasive IR developed on mouse ear skin, where we aim to visualize in real-time the cellular response of immune cells after reperfusion via multiphoton intravital imaging (MP-IVM).
Introduction
Ischémie- reperfusion (IRI) se produit lorsqu'il y a une hypoxie transitoire due à l'obstruction de la circulation sanguine (ischémie), suivie d'une ré-oxygénation subséquente des tissus (reperfusion). Dans la peau, l'ischémie-reperfusion (IR) est considéré comme l'un des facteurs qui contribuent à la physiopathologie des ulcères de pression, où alitement prolongé prédispose les patients hospitalisés à long terme à des blessures. Chez ces patients, la peau et les muscles sous – jacents sont constamment exposés à la pression du poids exercé sur les zones de proéminence osseuse, entraînant des blessures localisées qui, l' absence de traitement, peuvent devenir nécrotiques 1.
Les dommages-intérêts impliqués dans un IRI sont doubles. Au cours de l'ischémie, l'occlusion des vaisseaux sanguins conduit à une baisse drastique de l'apport d'oxygène aux tissus. Cela se traduit par une diminution de l'ATP et du pH, qui inactive les ATPases impliqués dans le métabolisme cellulaire. À son tour, le taux de calcium cellulaires pic et stressés ou c endommagésaunes subissent une apoptose ou une nécrose 2. La libération des contenus intracellulaires ou des motifs moléculaires de dommages associés (DAMP), comme la HMGB1, contribue à la réponse inflammatoire 3. La seconde insulte se produit lors de la reperfusion. Bien que les niveaux d'oxygène et de pH sont restaurées au cours de la reperfusion, cela se traduit par la génération d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), ce qui conduit à l'oxydation des lipides intracellulaires, l'ADN et les protéines. Par conséquent, les médiateurs pro-inflammatoires sont activés, ce qui déclenche une réponse inflammatoire secondaire qui comprend le recrutement de cellules immunitaires vers le site inflammatoire 2. Alors que la cascade d'événements biochimiques conduisant à la réponse inflammatoire a été bien décrite, la régulation spatiale et temporelle des activités de cellules immunitaires ne sont pas bien compris.
Ici, nous décrivons un modèle IR robuste sur la peau de l'oreille de souris à l'aide de serrage simple aimant. Couplé avec l'imagerie multiphotonique intravitale (MP-IVM), nousmis en place un modèle pour étudier les réponses inflammatoires in vivo qui se produisent après la reperfusion a lieu. La raison derrière le développement et l'utilisation de cette technique est d'essayer de comprendre comment les cellules interstitielles et infiltrant répondent à IR en temps réel.
Les modèles existants de IR en utilisant la technique de serrage sur le flanc de la peau sont très envahissantes, car elles nécessitent l'implantation chirurgicale de plaques d'acier dans le flanc de la peau, ce qui les rend moins-que-idéal pour les études immunologiques 4. Une technique de serrage non invasive similaire a été décrite dans le flanc de souris 5,6 de la peau. Toutefois, en raison de l'incorporation de la composante d'imagerie intravitale dans cette méthode, nous avons choisi à la place de la peau de l' oreille que le site IR ciblé, car il évite les mouvements dus à la respiration et offre la stabilité lors de l' imagerie 7,8. Par ailleurs, les sous-ensembles de leucocytes qui enjambent interstitiel sont identiques entre la peau de l'oreille et le flanc de la peau, même si lales nombres et les proportions peuvent varier légèrement 9. Ainsi, la peau de l'oreille représente un site d'imagerie idéal.
En outre, la plupart des données récupérées à partir de ces modèles IRI sont limités à des évaluations macroscopiques (de classement des ulcères) et les analyses microscopiques des indicateurs inflammatoires d'extrémité 10. En utilisant ce modèle, la visualisation en temps réel de la réponse cellulaire des neutrophiles après la reperfusion dans la peau d'une souris rapporteur fluorescent est activé. Un modèle d'imagerie de l' oreille intravitale précédemment publié est utilisé 8 avec des modifications supplémentaires (figures 1, 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Importance
IR est l'une des principales causes des ulcères de pression de la peau. Les premiers stades (I et II) des escarres de décubitus décrivent l'état de la peau humaine (par rapport aux tissus sous-cutanés sous-jacents et les muscles). Cependant, la compréhension de l'étiologie immunologique fait encore défaut. Ici, nous présentons un modèle simple et robuste IR sur la peau de l'oreille de la souris afin de combler cette lacune. Nous simulons l'ischémie par …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Thomas Graf for providing us with the LysM-eGFP mice.
Materials
| Mice strains | |||
| Lysozyme-GFP C57BL/6 | Thomas Graf, Center for Genomic Regulation | ||
| C57BL/6-C2J | Jackson Laboratories | 000058 | To be crossed with Lysozyme-GFP to generate albino Lysozyme-GFP for skin imaging |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| PBS | |||
| Viaflex 0.9% (wt/vol) saline | Baxter Healthcare | F8B1323 | |
| Ketamine (100 mg ml−1 ketamine hydrochloride | Parnell | Ketamine is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed | |
| Ilium Xylazil-20 (20 mg ml−1 xylazine hydrochloride) | Troy Laboratories | Xylazil-20 is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed. | |
| Evans blue (10 mg ml−1 in PBS or saline) | Sigma-Aldrich | 46160 | |
| Ultrapurified water | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Insulin syringe with needle | BD | 328838 | |
| Transfer pipettes | Biologix Research Company | 30-0135 | |
| 3M paper masking tape | 3M | 2214 | |
| Deckglaser microscope cover glass (22 mm × 32 mm) | Paul Marienfeld | 101112 | |
| Curved splinter forceps | Aesculap, B. Braun Melsungen | BD312R | |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser | ||
| Medical cotton-tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| C-fold towels | Kimberly-Clark | 20311 | |
| Kimwipes delicate task wipes | Kimtech Science | 34155 | |
| Gold-plated, N42-grade neodymium magnets, 12mm in diameter and 2mm thick | first4magnets | F656S | |
| Plastic guide, 10cm by 1.5cm (polyvinyl chloride material) | fold in half lengthwise, bind with masking tape and slot magnet in | ||
| High vacuum grease | Dow Corning | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | |||
| TriM Scope II single-beam two-photon microscope | LaVision BioTec | ||
| Tunable (680–1,080 nm) Coherent Chameleon Ultra II One Box Ti:sapphire laser (≥3.3 W at 800 nm; pulse length of 140 fs, 80 MHz repetition rate) | Coherent | ||
| Water-dipping objectives (20×, NA = 1.0) | Olympus | XLUMPLFLN20xW | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Miscroscope filter and mirror sets (for imaging GFP, SHG, Evans Blue) | |||
| 495 long-pass | Chroma | T495LPXR | |
| 560 lomg-pass | Chroma | T560LPXR | |
| 475/42 band-pass | Semrock | FF01-475/42-25 | |
| 525/50 band-pass | Chroma | ET525/50m | |
| 655/40 band-pass | Chroma | NC028647 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Skin-imaging stage platform (refer to diagram for assembly) | |||
| A metal base plate (126 mm × 126 mm × 1 mm) | |||
| A brass platform for the ear (79 mm × 19 mm; 1 mm thickness at side, 0.5 mm thickness in the middle; Fig. 1) with slit (1.7 mm × 1 mm; 1.5 mm away from long edge) | |||
| Two plastic blocks (10 mm in height)—for heat insulation | |||
| Curved holder, for positioning the control thermistor on the ear platform | |||
| Interface cable CC-28 with DIN connector and thermistors, one for the temperature control and the other for the temperature monitor | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640106 | connect the interface cable to both resistive heater blocks set at 35°C |
| Resistive heater blocks RH-2 | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640274 | Resistive heater blocks can heat the brass ear platform up to over 100 °C within minutes. Ensure that the control thermistor has been properly secured in the holder in order to avoid overheating. |
| Temperature controller TC-344B for the ear platform | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640101 | |
| Temperature controller TR-200 for mouse heating pad | Fine Science Tools | 21052-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Power supply for TR-200 | Fine Science Tools | 21051-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Heating pad | Fine Science Tools | 21060-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. |
| Animal rectal probe | Fine Science Tools | 21060-01 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. After connecting the rectal probe and heating pad to the temperature controller TR-200, set the temperature to 37 °C |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslip holder | |||
| 2 plastic rods, 1 cm in diameter, 10 cm in length | |||
| 1 plastic adaptor with holes drilled to accommodate rods (refer to diagram) | |||
| 3 plastic tightening screws for keeping plastic rods in place | |||
| 1 metal plate, 6 cm x 2.5 cm, with a 2 cm square cut at 1 end, 2 mm edge away from short edge | |||
| 1 pair of nut and bolt for attaching metal plate to plastic rod | |||
| 1 acrylic base (4 cm x 5 cm x 1.5 cm) with magnet to hold coverslip holder on skin-imaging stage platform. 1 rod is permanently fixed onto base. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging analysis software | |||
| Imaris v8.1.2 | Bitplane | ||
References
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