פגיעה איסכמיה reperfusion התרמה בעור האוזן עכבר Intravital multiphoton הדמיה של המערכת החיסונית
Summary
פרוטוקול זה מתאר את האינדוקציה של מודל איסכמיה-רה-פרפוזיה (IR) על עור אוזן עכבר באמצעות הידוק מגנט. באמצעות מודל הדמיה intravital שהותקן, אנחנו לומדים בתגובות דלקתיות vivo-רה-פרפוזיה פוסט. הרציונל מאחורי הפיתוח של טכניקה זו היא להרחיב את ההבנה של איך לויקוציטים להגיב פגיעה בעור IR.
Abstract
Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent re-oxygenation of the tissues (reperfusion). In the skin, ischemia-reperfusion (IR) is the main contributing factor to the pathophysiology of pressure ulcers. While the cascade of events leading up to the inflammatory response has been well studied, the spatial and temporal responses of the different subsets of immune cells to an IR injury are not well understood. Existing models of IR using the clamping technique on the skin flank are highly invasive and unsuitable for studying immune responses to injury, while similar non-invasive magnet clamping studies in the skin flank are less-than-ideal for intravital imaging studies. In this protocol, we describe a robust model of non-invasive IR developed on mouse ear skin, where we aim to visualize in real-time the cellular response of immune cells after reperfusion via multiphoton intravital imaging (MP-IVM).
Introduction
איסכמיה reperfusion פציעה (IRI) מתרחשת כאשר יש היפוקסיה חלף עקב החסימה של זרימת דם (איסכמיה) ואחריו מחדש חמצון הבא של הרקמות (רה-פרפוזיה). בעור, איסכמיה-רה-פרפוזיה (IR) הוא חשב להיות אחד הגורמים התורמים בפתופיזיולוגיה של פצעי לחץ, שם מנוחה במיטה ממושכת גוזר מאושפזים בבתי חולים לטווח ארוך על פשע. בחולים אלה, הוא את העור ואת השרירים הבסיסיים חשופים כל זמן בלחץ משקל המופעל על פני שטחים של בליטה גרמית, שגרמו לפציעה מקומית כי, אם אינו מטופל, עלול להפוך נימק 1.
הנזקים המעורבים IRI הם שתיים. במהלך איסכמיה, על חסימת כלי דם מובילה לירידה דרסטית של אספקת חמצן לרקמות. התוצאה היא ירידה של ATP ו- pH, אשר מנטרל ATPases מעורב חילוף חומרים תאיים. בתורו, רמות סידן הסלולר ספייק, והדגישו או פגום גאמות עוברים אפופטוזיס או נמק 2. שחרור תוכן תאי או דפוסים מולקולריים הקשורים ניזק (לח), כמו HMGB1, תורם את התגובה הדלקתית 3. העלבון השני מתרחש במהלך רה-פרפוזיה. למרות שרמות החמצן pH משוחזרים במהלך רה-פרפוזיה, זו התוצאה בדור של מינים חמצן תגובתי (ROS), אשר מוביל חמצון של שומנים תאיים, DNA וחלבונים. כתוצאה מכך, מתווכים פרו-דלקתיים מופעלים, אשר מגדירה את תגובה דלקתית משני המערבת את הגיוס של תאים חיסוניים לאתר הדלקתי 2. בעוד מפל של אירועים ביוכימיים שהובילו את התגובה הדלקתית תוארה היטב, הסדרת במרחב ובזמן של פעילות התא החיסון אינם מובנים היטב.
כאן אנו מתארים מודל IR חזק על עור עכבר אוזן באמצעות הידוק פשוט מגנט. יחד עם הדמיה intravital multiphoton (MP-IVM), אנוהוקם מודל ללמוד את התגובות הדלקתיות vivo ב המתרחשות לאחר רה-פרפוזיה מתרחש. הרציונל מאחורי פיתוח השימוש בטכניקה זו הוא לנסות להבין איך היא ביניים שחדר לתאים להגיב IR בזמן אמת.
מודלים קיימים של IR באמצעות טכניקת ההידוק בכנף העור הם פולשני מאוד, כפי שהם דורשים ההשתלה כירורגית של לוחות פלדה ב בכנף העור, מה שהופך אותם פחות מ-אידיאלי עבור מחקרים אימונולוגית 4. טכניקת הידוק דומה פולשני תוארה ב 5,6 אגף עור עכבר. עם זאת, בשל השילוב של מרכיב הדמית intravital בשיטה זו, אנו בחרנו ב- עור האוזן כאתר IR הממוקד, כפי שהוא עוקף תנועות עקב נשימה מציע יציבות במהלך הדמית 7,8. יתר על כן, תת לויקוציטים כי היקף interstitium זהים בין עור האוזן ואת אגף העור, אם כימספרים ופרופורציות עשויים להשתנות מעט 9. לכן, עור האוזן ייצג אתר הדמיה אידיאלי.
בנוסף, רוב הנתונים שנמצאו ממודלי IRI אלה מוגבלים הערכות מקרוסקופית (לדירוג של כיבים) וניתוחים מיקרוסקופים של אינדיקטורים דלקתיים סיום 10. באמצעות מודל זה, ויזואליזציה בזמן אמת של התגובה התאית של נויטרופילים לאחר רה-פרפוזיה בעור של עכבר כתב ניאון מופעלת. מודל הדמית אוזן intravital שפורסם בעבר מנוצל 8 עם שינויים נוספים (איורים 1, 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
מַשְׁמָעוּת
IR הוא אחד הגורמים המובילים של פצעי לחץ עור. בשלבים הראשונים (I ו- II) של פצעי לחץ לתאר את מצבו של העור האנושי (לעומת רקמות תת עורית הבסיסית והשרירים). עם זאת, הבנה של האטיולוגיה אימונולוגיים עדיין לוקה בחסר. כאן, אנו מציגים מ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Thomas Graf for providing us with the LysM-eGFP mice.
Materials
| Mice strains | |||
| Lysozyme-GFP C57BL/6 | Thomas Graf, Center for Genomic Regulation | ||
| C57BL/6-C2J | Jackson Laboratories | 000058 | To be crossed with Lysozyme-GFP to generate albino Lysozyme-GFP for skin imaging |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| PBS | |||
| Viaflex 0.9% (wt/vol) saline | Baxter Healthcare | F8B1323 | |
| Ketamine (100 mg ml−1 ketamine hydrochloride | Parnell | Ketamine is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed | |
| Ilium Xylazil-20 (20 mg ml−1 xylazine hydrochloride) | Troy Laboratories | Xylazil-20 is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed. | |
| Evans blue (10 mg ml−1 in PBS or saline) | Sigma-Aldrich | 46160 | |
| Ultrapurified water | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Insulin syringe with needle | BD | 328838 | |
| Transfer pipettes | Biologix Research Company | 30-0135 | |
| 3M paper masking tape | 3M | 2214 | |
| Deckglaser microscope cover glass (22 mm × 32 mm) | Paul Marienfeld | 101112 | |
| Curved splinter forceps | Aesculap, B. Braun Melsungen | BD312R | |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser | ||
| Medical cotton-tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| C-fold towels | Kimberly-Clark | 20311 | |
| Kimwipes delicate task wipes | Kimtech Science | 34155 | |
| Gold-plated, N42-grade neodymium magnets, 12mm in diameter and 2mm thick | first4magnets | F656S | |
| Plastic guide, 10cm by 1.5cm (polyvinyl chloride material) | fold in half lengthwise, bind with masking tape and slot magnet in | ||
| High vacuum grease | Dow Corning | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | |||
| TriM Scope II single-beam two-photon microscope | LaVision BioTec | ||
| Tunable (680–1,080 nm) Coherent Chameleon Ultra II One Box Ti:sapphire laser (≥3.3 W at 800 nm; pulse length of 140 fs, 80 MHz repetition rate) | Coherent | ||
| Water-dipping objectives (20×, NA = 1.0) | Olympus | XLUMPLFLN20xW | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Miscroscope filter and mirror sets (for imaging GFP, SHG, Evans Blue) | |||
| 495 long-pass | Chroma | T495LPXR | |
| 560 lomg-pass | Chroma | T560LPXR | |
| 475/42 band-pass | Semrock | FF01-475/42-25 | |
| 525/50 band-pass | Chroma | ET525/50m | |
| 655/40 band-pass | Chroma | NC028647 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Skin-imaging stage platform (refer to diagram for assembly) | |||
| A metal base plate (126 mm × 126 mm × 1 mm) | |||
| A brass platform for the ear (79 mm × 19 mm; 1 mm thickness at side, 0.5 mm thickness in the middle; Fig. 1) with slit (1.7 mm × 1 mm; 1.5 mm away from long edge) | |||
| Two plastic blocks (10 mm in height)—for heat insulation | |||
| Curved holder, for positioning the control thermistor on the ear platform | |||
| Interface cable CC-28 with DIN connector and thermistors, one for the temperature control and the other for the temperature monitor | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640106 | connect the interface cable to both resistive heater blocks set at 35°C |
| Resistive heater blocks RH-2 | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640274 | Resistive heater blocks can heat the brass ear platform up to over 100 °C within minutes. Ensure that the control thermistor has been properly secured in the holder in order to avoid overheating. |
| Temperature controller TC-344B for the ear platform | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640101 | |
| Temperature controller TR-200 for mouse heating pad | Fine Science Tools | 21052-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Power supply for TR-200 | Fine Science Tools | 21051-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Heating pad | Fine Science Tools | 21060-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. |
| Animal rectal probe | Fine Science Tools | 21060-01 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. After connecting the rectal probe and heating pad to the temperature controller TR-200, set the temperature to 37 °C |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslip holder | |||
| 2 plastic rods, 1 cm in diameter, 10 cm in length | |||
| 1 plastic adaptor with holes drilled to accommodate rods (refer to diagram) | |||
| 3 plastic tightening screws for keeping plastic rods in place | |||
| 1 metal plate, 6 cm x 2.5 cm, with a 2 cm square cut at 1 end, 2 mm edge away from short edge | |||
| 1 pair of nut and bolt for attaching metal plate to plastic rod | |||
| 1 acrylic base (4 cm x 5 cm x 1.5 cm) with magnet to hold coverslip holder on skin-imaging stage platform. 1 rod is permanently fixed onto base. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging analysis software | |||
| Imaris v8.1.2 | Bitplane | ||
References
- Black, J., et al. National Pressure Ulcer Advisory Panel’s updated pressure ulcer staging system. Adv Skin Wound Care. 20, 269-274 (2007).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. Cell biology of ischemia/reperfusion injury. Int Rev Cell Mol Biol. 298, 229-317 (2012).
- Huebener, P., et al. The HMGB1/RAGE axis triggers neutrophil-mediated injury amplification following necrosis. J Clin Invest. 125, 539-550 (2015).
- Wassermann, E., et al. A chronic pressure ulcer model in the nude mouse. Wound Repair Regen. 17, 480-484 (2009).
- Stadler, I., Zhang, R. Y., Oskoui, P., Whittaker, M. S., Lanzafame, R. J. Development of a simple, noninvasive, clinically relevant model of pressure ulcers in the mouse. J Invest Surg. 17, 221-227 (2004).
- Tsuji, S., Ichioka, S., Sekiya, N., Nakatsuka, T. Analysis of ischemia-reperfusion injury in a microcirculatory model of pressure ulcers. Wound Repair Regen. 13, 209-215 (2005).
- Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J Invest Dermatol. 131, 2058-2068 (2011).
- Li, J. L., et al. Intravital multiphoton imaging of immune responses in the mouse ear skin. Nat Protoc. 7, 221-234 (2012).
- Tong, P. L., et al. The skin immune atlas: three-dimensional analysis of cutaneous leukocyte subsets by multiphoton microscopy. J Invest Dermatol. 135, 84-93 (2015).
- Saito, Y., et al. The loss of MCP-1 attenuates cutaneous ischemia-reperfusion injury in a mouse model of pressure ulcer. J Invest Dermatol. 128, 1838-1851 (2008).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96, 719-726 (2000).
- Roediger, B., Ng, L. G., Smith, A. L., Fazekasde de St Groth, B., Weninger, W. Visualizing dendritic cell migration within the skin. Histochem Cell Biol. 130, 1131-1146 (2008).
- Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils. Sci Rep. 3, 1913 (2013).
- Ng, L. G., et al. Migratory dermal dendritic cells act as rapid sensors of protozoan parasites. PLoS Pathog. 4, e1000222 (2008).
- Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy. J Vis Exp. , e51805 (2014).
- Beltman, J. B., Maree, A. F., de Boer, R. J. Analysing immune cell migration. Nat Rev Immunol. 9, 789-798 (2009).
