Un método eficiente para el aislamiento de ARN altamente purificada a partir de semillas para uso en el Análisis Cuantitativo de transcriptoma
Summary
We have succeeded in establishing a method for RNA isolation from plant seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method is suitable for monitoring the expression of genes with low level transcripts in seeds.
Abstract
Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as industrial materials. Gene expression profiles are powerful tools for investigating metabolic regulation in plant cells. Therefore, detailed, accurate gene expression profiles during seed development are required for crop breeding. Acquiring highly purified RNA is essential for producing these profiles. Efficient methods are needed to isolate highly purified RNA from seeds. Here, we describe a method for isolating RNA from seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method enables highly purified RNA to be obtained from seeds without the use of phenol, chloroform, or additional processes for RNA purification. This method is applicable to Arabidopsis, rapeseed, and soybean seeds. Our method will be useful for monitoring the expression patterns of low level transcripts in developing and mature seeds.
Introduction
Las plantas producen semillas, que dan lugar a la generación siguiente. Las semillas se acumulan grandes cantidades de reservas de almacenamiento, tales como aceites, hidratos de carbono y proteínas, para el crecimiento post-germinativa. Los seres humanos utilizan las reservas de almacenamiento de las semillas como fuentes de alimentación humana y animal, y por lo tanto las semillas de plantas son uno de los principales proveedores de materia orgánica comestible en todo el mundo. El aumento de los rendimientos de semilla es un reto importante en la ciencia de las plantas.
Dado que las reservas de almacenamiento de semillas son fuentes de valor comercial de alimentos y materiales industriales, los mecanismos moleculares que subyacen a la regulación del metabolismo de estas reservas han sido ampliamente investigados 1-6. al aclarar más estos mecanismos será útil para aumentar el rendimiento de semilla en los cultivos. Las semillas se desarrollan en los ovarios después de la fertilización de las plantas, y que maduran a través de una serie de etapas de desarrollo 1,6,7. entender aún más el desarrollo de semillas mecanismo molecular subyacente requiere detallada, Perfiles de expresión génica precisas de una serie de semillas en desarrollo a ser producidos. Sin embargo, las altas cantidades de aceites, proteínas, hidratos de carbono, y los polifenoles en semillas de plantas hacen que sea difícil aislar ARN altamente purificada, que se opone a los perfiles precisa de la expresión génica.
Aquí, se introduce un método eficiente para el aislamiento de ARN a partir de las semillas oleaginosas que contienen grandes cantidades de aceites, proteínas y polifenoles. Usando este método, los investigadores podrán preparar ARN altamente purificada. Dicho ARN será útil para el seguimiento de los cambios en la transcripción de genes clave que controlan la regulación del metabolismo de las reservas de almacenamiento de semillas oleaginosas en el desarrollo y maduros.
Protocol
Representative Results
Discussion
los perfiles de expresión de genes contribuyen a nuestra comprensión de la fisiología de las plantas; Por lo tanto, los métodos de aislamiento de ARN específico se han desarrollado para cada condición de muestra 9-12. Se investigaron los procesos que se inhibe durante el aislamiento de ARN a partir de semillas y se ha encontrado que el ARN a membranas de sílice fue gravemente inhibida. Grandes cantidades de petróleo, proteínas y polifenoles inhiben el aislamiento de ARN. Hemos modificado el proceso d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al personal de la genómica funcional y Facility Fondo para espectrografía y Bioimagen, Nibb instalaciones centrales de la investigación y en un Centro de Investigación de Plantas Modelo, Nibb bio-Center.
Materials
| RNeasy Plant Mini Kit | QIAGEN | 74904 | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P5288-100G | |
| HOMOGENIZER S-303 | AS ONE | 1-1133-02 | |
| NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-NDL-US-CAN | |
| PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) | TAKARA | RR037A | |
| KAPA SYBR Fast qPCR kit | Kapa biosystems | KK4601 |
References
- Hills, M. J. Control of storage-product synthesis in seeds. Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 302-308 (2004).
- Li-Beisson, Y., et al. Acyl-lipid metabolism. Arabidopsis Book. 11, e0161 (2013).
- Bates, P. D., Stymne, S., Ohlrogge, J. Biochemical pathways in seed oil synthesis. Curr Opin Plant Biol. 16 (3), 358-364 (2013).
- Santos-Mendoza, M., et al. Deciphering gene regulatory networks that control seed development and maturation in Arabidopsis. Plant J. 54 (4), 608-620 (2008).
- Durrett, T. P., Benning, C., Ohlrogge, J. Plant triacylglycerols as feedstocks for the production of biofuels. Plant J. 54 (4), 593-607 (2008).
- Kanai, M., et al. The Plastidic DEAD-box RNA helicase 22, HS3, is essential for plastid functions both in seed development and in seedling growth. Plant Cell Physiol. 54 (9), 1431-1440 (2013).
- Kanai, M., et al. Extension of oil biosynthesis during the mid-phase of seed development enhances oil content in Arabidopsis seeds. Plant Biotechnol J. 14 (5), 1241-1250 (2016).
- Dekkers, B. J., et al. Identification of reference genes for RT-qPCR expression analysis in Arabidopsis and tomato seeds. Plant Cell Physiol. 53 (1), 28-37 (2012).
- Salzman, R. A., et al. An improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Mol Biol Rep. 17 (1), 11-17 (1999).
- Vicient, C. M., Delseny, M. Isolation of total RNA from Arabidopsis thaliana seeds. Anal Biochem. 268 (2), 412-413 (1999).
- Wang, G. F., et al. Isolation of high quality RNA from cereal seeds containing high levels of starch. Phytochem Analysis. 23 (2), 159-163 (2012).
- Birtic, S., Kranner, I. Isolation of high-quality RNA from polyphenol-, polysaccharide- and lipid-rich seeds. Phytochem Analysis. 17 (3), 144-148 (2006).
