أسلوب الشذرة إكسو: تحديد التفاعلات البروتين الحمض النووي مع قرب قاعدة زوج الدقة
Summary
Here, we present a protocol to achieve near base pair resolution of protein-DNA interactions. This is obtained by exonuclease treatment of DNA fragments selectively enriched by chromatin immunoprecipitation (ChIP-exo) followed by high throughput sequencing.
Abstract
الكروماتين مناعي (رقاقة) هو أداة لا غنى عنها في مجالات علم التخلق وتنظيم الجين الذي يعزل تفاعلات البروتين-DNA محددة. يستخدم رقاقة بالإضافة إلى التسلسل إنتاجية عالية (رقاقة وما يليها) عادة لتحديد الموقع الجيني من البروتينات التي تتفاعل مع لونين. ومع ذلك، ويعوق رقاقة وما يليها من قبل منخفضة نسبيا قرار رسم الخرائط من عدة مئات من أزواج قاعدة وعالية إشارة الخلفية. طريقة الشذرة إكسو هو نسخة منقحة من رقاقة وما يليها أن تحسن بشكل كبير على كل من قرار والضوضاء. والفرق الرئيسي للمنهجية الشذرة إكسو هو إدماج الهضم امدا نوكلياز خارجية في سير العمل إعداد مكتبة للبصمة فعال اليسار واليمين 5 الحدود "الحمض النووي للموقع تشعبي البروتين الحمض النووي. ثم يتعرض للمكتبات رقاقة إكسو إلى ارتفاع التسلسل الإنتاجية. يمكن الاستفادة من البيانات الناتجة لتقديم رؤى فريدة وفائقة الدقة في التنظيم س الوظيفيو الجينوم. هنا، نحن تصف طريقة الشذرة إكسو أن لدينا الأمثل وتبسيط نظم الثدييات والجيل القادم من منصة التسلسل عن طريق التوليف.
Introduction
الكروماتين مناعي (رقاقة) هو وسيلة قوية لدراسة آليات تنظيم الجينات من خلال إثراء انتقائي لشظايا الحمض النووي التي تتفاعل مع بروتين معين في الخلايا الحية. وقد تطورت أساليب اكتشاف شظايا الحمض النووي المخصب الشذرة كما يحسن التكنولوجيا، من الكشف عن مكان واحد (معيار الشذرة QPCR) إلى التهجين على ميكروأرس النوكليوتيد (رقاقة رقاقة) إلى التسلسل الإنتاجية العالية (رقاقة وما يليها) 1. على الرغم من رقاقة وما يليها شهدت تطبيق على نطاق واسع، والتباين لونين والتفاعلات الحمض النووي غير محددة أعاقت نوعية البيانات التي تؤدي إلى المغلوطة ورسم الخرائط غير دقيقة. وللتغلب على هذه القيود، طور الدكتور فرانك بف طريقة الشذرة إكسو 2. والسمة البارزة لالشذرة إكسو هو أنه يشتمل على 5 'إلى 3' نوكلياز خارجية، البصمة بشكل فعال عامل النسخ المواقع ملزمة. ونتيجة لذلك، فإن منهجية الشذرة إكسو تحقق دقة أعلى، أكبر مجموعة ديناميكية من detectioن، وانخفاض الضوضاء في الخلفية.
على الرغم من أن الشذرة إكسو هو أكثر تحديا من الناحية الفنية لسيده من رقاقة وما يليها، واعتمادها على نطاق واسع بأنها تهدف الدراسات للحصول على أفكار ذات دقة عالية جدا فريدة من نوعها باستخدام النظم البيولوجية المتنوعة 3-8. في الواقع، تم تطبيق الشذرة إكسو بنجاح إلى البكتيريا والخميرة والجرذان والفئران، ونظم خلايا الإنسان. وكدليل على المبدأ، تم استخدام رقاقة-إكسو في الأصل لتحديد عزر ملزم دقيق لعدد قليل من الخميرة النسخ عوامل 2. وقد استخدمت هذه التقنية أيضا في الخميرة لدراسة تنظيم النسخ مجمع قبل البدء، وإلى فك هيكل subnucleosomal من مختلف الهستونات 9،10. وفي الآونة الأخيرة، ونحن الاستدانة الشذرة إكسو لحل TFIIB المجاورة وبول الثاني الأحداث في المروجين الإنسان ملزمة، وأظهرت أن النسخ متباينة على نطاق واسع ينشأ من بدء متميزة مجمعات 11.
تم تحسين سير العمل المعروضة هنا والصورةtreamlined لالثدييات الشذرة إكسو (الشكل 1). أولا، يتم التعامل مع الخلايا الحية ثقافة الأولية أو الأنسجة مع الفورمالدهايد للحفاظ على الجسم الحي في تفاعلات البروتين الحمض النووي من خلال تشعبي التساهمية. وهي lysed الخلايا ولونين المنفصمة إلى ~ 100-500 زوج قاعدة شظايا الحجم. رقاقة ثم يغني بشكل انتقائي لشظايا الحمض النووي crosslinked للبروتين من الفائدة. عند هذه النقطة، يتم إعداد مكتبات رقاقة وما يليها عادة، مما يحد بطبيعتها القرار كشف أن متوسط حجم جزء من بضع مئات من أزواج قاعدة. ومع ذلك، الشذرة إكسو يتغلب على هذا التحديد عن طريق تقليم اليسار واليمين 5 الحدود "الحمض النووي للموقع تشعبي البروتين الحمض النووي مع نوكلياز خارجية امدا. ثم يتم إنشاء مكتبات التسلسل من نوكلياز خارجية الحمض النووي يهضم كما هو موضح أدناه. تمثل المتداخلة 5 الحدود الناتجة 'بصمة في الجسم الحي للتفاعل البروتين الحمض النووي (الشكل 1، الخطوة 14)، ويتم الكشف عنها بواسطة عالية التسلسل الإنتاجية. بديلهوغ منهجية الشذرة إكسو هي أكثر انخراطا من رقاقة وما يليها، والتحولات بين معظم الخطوات تتطلب غسل حبة بسيط، الذي يقلل من فقدان العينة وتقلب التجريبية. الأهم من ذلك، منذ الشذرة إكسو هو نسخة منقحة من رقاقة وما يليها، أي عينة غير ناجحة مع رقاقة وما يليها ينبغي أيضا أن تكون ناجحة مع رقاقة-إكسو.
في الجسم الحي البصمة للتفاعلات البروتين الحمض النووي مع النتائج الشذرة إكسو في بنية بيانات متميزة جوهريا عن رقاقة وما يليها. على الرغم من المتصلين رقاقة وما يليها المشترك يمكن تطبيقها على البيانات الشذرة إكسو، للحصول على مكالمات الذروة أدق نوصي المعلوماتية الحيوية الأدوات المصممة خصيصا مع بنية فريدة من نوعها من البيانات الشذرة إكسو في الاعتبار. وتشمل هذه Genetrack، GEM، صولجان، Peakzilla، وExoProfiler 12-15.
Protocol
Representative Results
Discussion
نقدم بروتوكول الجيني وظيفية لتحديد موقع ملزم دقيق لونين تتفاعل البروتينات بطريقة غير متحيزة، على نطاق الجينوم في القريب قرار الزوج القاعدة. الخطوة الأكثر أهمية لتحقيق قرب قاعدة قرار التعيين الزوج هو العلاج نوكلياز خارجية من الحمض النووي المخصب الشذرة في حين لا ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Venters Lab and members of the Molecular Physiology and Biophysics Department for helpful discussions. Special thanks to Frank Pugh for his guidance, mentoring, and many insightful discussions on the nuances of ChIP-exo while I was a post-doctoral fellow in his laboratory.
Materials
| 37% formaldehyde, methanol free, 10x10ml ampules | ThermoFisher Scientific | 28908 | Section 3 |
| Complete Protease Inhibitor cocktail (CPI) | Roche Life Science | 11873580001 | Sections 4, 8 |
| Bioruptor sonicator | Diagenode | UCD200 | Section 5 |
| 15 ml polystyrene tubes | BD Falcon | 352095 | Section 5 |
| MagSepharose Protein G Xtra beads | GE Healthcare | 28-9670-66 | Section 6 |
| DynaMag-1.5ml Side Magnetic Rack | Invitrogen | 12321D | Sections 6-17, 22 |
| Mini-Tube Rotator | Fisher Scientific | 05-450-127 | Sections 7, 22 |
| T4 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0203 | Section 9 |
| DNA Polymerase I, Klenow | New England BioLabs | M0210 | Section 9 |
| 10x NEBuffer 2 (10x Reaction Buffer 2) | New England BioLabs | B7002 | Sections 9-11, 13, 15, 20 |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 | Sections 9-16 |
| ATP | Roche Life Science | 010419979001 | Sections 9, 11, 13 |
| dNTPs | New England BioLabs | N0447 | Sections 9, 12, 19, 23 |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201 | Sections 9, 13 |
| dATP | New England BioLabs | N0440 | Sections 10, 20 |
| Klenow 3'-5' Exo Minus | New England BioLabs | M0212 | Sections 10, 20 |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202 | Sections 11, 21 |
| Φ-29 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0269 | Sections 12, 19 |
| 10x Φ-29 Buffer | New England BioLabs | B0269 | Sections 12, 19 |
| Lambda Exonuclease | New England BioLabs | M0262 | Section 14 |
| 10x Lambda Buffer | New England BioLabs | B0262 | Section 14 |
| RecJf Exonuclease | New England BioLabs | M0264 | Section 15 |
| Proteinase K | Roche Life Science | 03115828001 | Section 16 |
| Glycogen | Roche Life Science | 010901393001 | Section 18 |
| 10x T4 Ligase Buffer | New England BioLabs | B0202 | Section 21 |
| AMPure XP (clean up) beads | Beckman Coulter | A63881 | Section 22 |
| Q5 Hot Start DNA Polymerase | New England BioLabs | M0493 | Section 23 |
| 5x Q5 Buffer (5x PCR Buffer) | New England BioLabs | B9027 | Section 23 |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen | Q33216 | Section 25 |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Section 25 |
| Optical Clear Qubit tubes | Invitrogen | Q32856 | Section 26 |
| Qubit dsDNA High Sensitivity Assay kit | Invitrogen | Q32851 | Section 26 |
References
- Venters, B. J., Pugh, B. F. How eukaryotic genes are transcribed. Crit Rev Biochem Mol Biol. 44, 117-141 (2009).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147, 1408-1419 (2011).
- Chen, J., et al. Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells. Cell. 156, 1274-1285 (2014).
- Wales, S., Hashemi, S., Blais, A., McDermott, J. C. Global MEF2 target gene analysis in cardiac and skeletal muscle reveals novel regulation of DUSP6 by p38MAPK-MEF2 signaling. Nucleic acids research. 42, 11349-11362 (2014).
- Cho, S., et al. The architecture of ArgR-DNA complexes at the genome-scale in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 43, 3079-3088 (2015).
- Katainen, R., et al. CTCF/cohesin-binding sites are frequently mutated in cancer. Nat Genet. 47, 818-821 (2015).
- Murphy, M. W., et al. An ancient protein-DNA interaction underlying metazoan sex determination. Nat Struct Mol Biol. 22, 442-451 (2015).
- Zere, T. R., et al. Genomic Targets and Features of BarA-UvrY (-SirA) Signal Transduction Systems. PLoS One. 10, e0145035 (2015).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483, 295-301 (2012).
- Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L., Pugh, B. F. Subnucleosomal structures and nucleosome asymmetry across a genome. Cell. , 1377-1388 (2014).
- Pugh, B. F., Venters, B. J. Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes. PLoS One. 11, e0149339 (2016).
- Albert, I., Wachi, S., Jiang, C., Pugh, B. F. GeneTrack–a genomic data processing and visualization framework. Bioinformatics. 24, 1305-1306 (2008).
- Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints. PLoS computational biology. 8, e1002638 (2012).
- Bardet, A. F., et al. Identification of transcription factor binding sites from ChIP-seq data at high resolution. Bioinformatics. 29, 2705-2713 (2013).
- Wang, L., et al. MACE: model based analysis of ChIP-exo. Nucleic Acids Res. 42, e156 (2014).
- Bentley, D. R., et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456, 53-59 (2008).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 21, Unit 21.24 (2012).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22, 1813-1831 (2012).
- Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties. Genome Biol. 14, R147 (2013).
- He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotechnol. 33, 395-401 (2015).
