Summary

Producción, Cristalización y determinación de la estructura de<em> C. difícil</em> PPEP-1 a través de microsiembra y Zinc-SAD

Published: December 30, 2016
doi:

Summary

Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is a secreted metalloprotease and promising drug-target from the human pathogen Clostridium difficile. Here we describe all methods necessary for the production and structure determination of this protein.

Abstract

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a target for future development of inhibitors to decrease the virulence of the pathogen. To perform biophysical and structural characterization as well as inhibitor screening, large amounts of pure and active protein will be needed. We have developed a protocol for efficient production and purification of PPEP-1 by the use of E. coli as the expression host yielding sufficient amounts and purity of protein for crystallization and structure determination. Additionally, using microseeding, highly intergrown crystals of PPEP-1 can be grown to well-ordered crystals suitable for X-ray diffraction analysis. The methods could also be used to produce other recombinant proteins and to study the structures of other proteins producing intergrown crystals.

Introduction

Clostridium difficile es una de las principales causas de las infecciones diarrea asociada a antibióticos nosocomiales 1. Esta bacteria anaerobia Gram-positiva se transmite a través de su forma de esporas a través de la vía fecal-oral. En la última década, la nueva '' epidemia '' o '' hypervirulent '' (por ejemplo, las cepas de BI / NAP1 / 027) produjo un aumento drástico de las nuevas infecciones y las tasas de mortalidad en América del Norte y Europa 2. C. difficile enfermedad -asociado (CDAD) es una amenaza para la vida inflamación del colon con altas tasas de mortalidad 3. Los síntomas varían desde diarrea 4 a 5 colitis pseudomembranosa y el megacolon tóxico menudo fatal 6.

El tratamiento de la CDAD es difícil, ya que las cepas virulentas son resistentes a múltiples fármacos y la tasa de recurrencia es alto 7. En la terapia de momento incluye el metronidazol antibióticos, fidaxomicina o vancomicina, o en repetitivamente los casos recurrentes de trasplante fecal microbiota. Se necesitan con urgencia 8 nuevas estrategias terapéuticas. Algunos avances se registra como el anticuerpo monoclonal terapéutico Bezlotoxumab, apuntando a la toxina de C. difficile B 9, recientemente ha superado con éxito la fase III de ensayos clínicos y fue presentado para su aprobación por la FDA y EMA. Además, los nuevos antibióticos se están probando en el momento en diferentes etapas de los ensayos clínicos 10.

Para desarrollar un tratamiento eficaz nuevas dianas terapéuticas deben ser identificados. El recientemente descubierto C. difficile proteasa endopeptidasa-1-prolina prolina (PPEP-1; CD2830 / Zmp1; EC 3.4.24.89) es un objetivo tan prometedor, ya que la falta de PPEP-1 en una cepa knock-out disminuye la virulencia de C . difficile in vivo 11. PPEP-1 es una metaloproteasa secretada 12,13 escindir dos adhesinas de C. difficile en su C-terminal 13 liberando así la bacter adherenteia del epitelio intestinal humano. Por lo tanto, está implicado en el mantenimiento del equilibrio entre el fenotipo sésiles y móviles de C. difficile. Para desarrollar inhibidores selectivos contra PPEP-1 y para entender la forma en que reconoce sus sustratos conocimiento íntimo de su estructura tridimensional es indispensable. Hemos resuelto la primera estructura cristalina de PPEP-1 sola y en complejo con un péptido sustrato 14. PPEP-1 es la proteasa primera sabido que selectivamente escinde enlaces peptídicos entre dos residuos de prolina 15. Se une el sustrato de una manera de doble retorcido y la estabiliza a través de una red alifático-aromático prolongado de residuos localizados en el S-bucle que cubre el sitio activo de la proteasa 14. Este modo de unión al sustrato es aplicable sólo a PPEP-1 y no se encuentra en proteasas humanas hasta la fecha. Esto hace que sea un objetivo prometedor fármaco, y fuera de objetivo efectos de los inhibidores muy improbables.

Para el desarrollo y la pantalla selectiva PPEP-1 inhibitors en el futuro se necesita una gran cantidad de proteína pura y monodispersa PPEP-1. Además, para determinar el modo de unión de los primeros inhibidores, estructuras co-cristalinas con PPEP-1 tendrá que ser determinado. En nuestras manos PPEP-1 produce constantemente cristales intergrown. Por lo tanto, hemos desarrollado un procedimiento de optimización para producir monocristales calidad de difracción de PPEP-1. En este protocolo se describe en detalle la solución de producción, purificación, cristalización y la estructura de PPEP-1 14. Utilizamos la expresión intracelular en Escherichia coli de una variante PPEP-1 carece de la secuencia señal de secreción, cromatografía de afinidad y cromatografía de exclusión de tamaño con la eliminación de la etiqueta de purificación, seguido por microsiembra 16 en una pantalla de la optimización y la determinación de la estructura a través de zinc única longitud de onda de dispersión anómala (zinc-SAD) 17. Este protocolo puede ser adaptado para la determinación de la producción y la estructura de otras proteínas (por ejemplo, </ Em> metaloproteasas) y en particular para las proteínas que producen cristales entrecrecidos. A petición, el ADN del plásmido de la construcción (pET28a-NHis-rPPEP-1) y los datos de difracción se puede proporcionar con fines educativos.

Protocol

1. Clonación y Construir Diseño Clon de la secuencia de codones optimizados (para E. coli) de C. difficile PPEP-1 sin el péptido señal [los aminoácidos 27-220, llamado de aquí en adelante recombinante PPEP-1 (rPPEP-1) 11] en el vector pET28a usando Nde I y Xho I sitios de restricción (Figura 1) con un codón de parada en el (vector resultante pET28a-NHis-rPPEP-1) extremo 3 '. Esto produce una N-terminal 6xHis de etiquetado de proteína…

Representative Results

rPPEP-1 se sobreexpresa en varias cepas de E. coli, con el rendimiento más alto en E. coli BL21 (DE3) Star (Figura 1C). Después de la primera etapa de cromatografía de afinidad NiNTA la etiqueta 6xHis se puede escindir con éxito de la mayoría de la proteína y en el segundo paso NiNTA proteína no digerida se puede separar completamente de la proteína trombina digerido (Figura 1D). En una columna S200 16/600 rPPEP-1 sin etiqueta m…

Discussion

La cristalografía de rayos X sigue siendo el método más rápido y más preciso para determinar las estructuras tridimensionales de resolución casi atómica de proteínas 28. Sin embargo, requiere el crecimiento de cristales únicos bien ordenadas. Estos a menudo son difíciles de conseguir y el estado cristalino es artificial. Sin embargo, una comparación de las estructuras de proteínas determinadas por cristalografía de rayos X con los determinados por otros métodos, especialmente NMR, muestra genera…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos al personal de la X06DA línea de luz en la fuente de luz suiza, Paul-Scherrer-Institute, Villigen, Suiza por su apoyo durante la recolección de datos de sincrotrón. Estamos muy agradecidos a Monika Gompert por su excelente apoyo técnico. El proyecto fue apoyado por la Universidad de Colonia y conceder INST 216 / 682-1 Fugg del Consejo de Investigación Alemán. Una beca de doctorado de la Escuela Internacional de Posgrado en Salud y Enfermedad Desarrollo de CP se reconoce. La investigación que lleva a estos resultados ha recibido financiación del Séptimo Programa Marco de la Comunidad Europea (FP7 / 2007-2013) en virtud de acuerdo de subvención nº 283570 (BioStruct-X).

Materials

Genes / Vectors / cell strains
pET28a vector Merck-Millipore 69864 Thrombin cleavable N-terminal His-tag
E. coli strain BL21 (DE3) Star ThermoFisher Scientific C601003 RNase H deficient
Codon-optimized gene (for E. coli) of PPEP-1 (CD630_28300) Geneart (Thermo Fisher Scientific) custom amino acids 27-220
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Yeast extract any
Tryptone any
Antifoam B Sigma-Aldrich A5757 aqueous-silicone emulsion
Agar any
Kanamycin any
IPTG AppliChem A1008
Tris-HCl AppliChem A1087 Buffer grade
NaCl any Buffer grade
DNaseI AppliChem A3778
Imidazole AppliChem A1073 Buffer grade
Thrombin Sigma-Aldrich T4648
Ammonium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 215996
Glycerol 100% any purest grade
Sucrose Sigma-Aldrich 84097
Liquid nitrogen any for storage and cryocooling of crystals
Name Company Catalog Number Comments
Equipment (general)
Shaking incubator any providing temperatures of 20 °C – 37 °C
Glassware any baffled Erlenmeyer flasks (50 ml – 2.8L)
Centrifuge for large culture volumes any centrifuge for processing volumes up to 12 L
Sonicator Vibra-Cell VCX500 Sonics SO-VCX500 or any other sonicator / cell disruptor
Ultracentrifuge any centrifuge providing speeds up to 150.000 x g
NiNTA Superflow resin Qiagen
Empty Glass Econo-Column Bio-Rad 7371007 or any other empty glass or plastic column
Size exclusion chromatography column HiLoad Superdex 200 16/600 GE Healthcare 28989335
Chromatography system Äkta Purifier GE Healthcare 28406264 or any other chromatography system
Dialysis tubing Spectra/Por 3 Spectrum Labs 132724
Dialysis tubing closures Spectrum Labs 132738
Ultrafiltration units (concentrators) 10.000 NWCO any
UV-Vis spectrophotometer any
Name Company Catalog Number Comments
Equipment (crystallography)
Low volume pipette 0.1-10 µl any
Positive displacement pipette Microman M10 Gilson F148501
Crystallization robot any
96-well crystallization plates TTP IQ with three protein wells TTP 4150-05810 or any other 96-well crystallization plate 
24-well CombiClover Junior Plate Jena Bioscience EB-CJR
Crystal Clear Sealing Tape Hampton Research HR3-511
Siliconized Glass Cover Slides Hampton Research HR3-225
Commercial crystallization screens: SaltRx, Index, PEG/Ion, Crystal Hampton Research diverse
Commercial crystallization screens: Wizard, PACT++, JCSG++ Jena Bioscience diverse
JBS Beads-for-Seeds Jena Bioscience CO-501
CrystalCap SPINE HT (nylon loops) Hampton Research diverse loop sizes 0.025 mm – 0.5 mm
CrystalCap Vial Hampton Research HR4-904
Cryogenic Foam Dewar 800 ml Hampton Research HR4-673
Cryogenic Foam Dewar 2L Hampton Research HR4-675
Vial Clamp, Straight Hampton Research HR4-670
CrystalWand Magnetic, Straight Hampton Research HR4-729
CryoCane 6 Vial Holder Hampton Research HR4-711
CryoSleeve Hampton Research HR4-708
CryoCane Color Coder – White Hampton Research HR4-713
Scalpel any
Straight microforcep any for manipulation of sealing tape. etc.
Acupuncture needle any e.g. from a pharmacy
Stereo microscope any for inspection of crystallization plates and crystal mounting, magnification up to 160X

References

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Pichlo, C., Montada, A. A., Schacherl, M., Baumann, U. Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD. J. Vis. Exp. (118), e55022, doi:10.3791/55022 (2016).

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