את assay נימי מזין מודד צריכת המזון ב<em> תסיסנית</em
Summary
The CApillary FEeder (CAFE) assay is a simple, budget-friendly, highly reliable method for investigating mechanisms underlying food intake. Used with the highly versatile genetic model organism Drosophila melanogaster, it provides a powerful means of gaining new insights into regulatory mechanisms of food intake.
Abstract
For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of the right type and quantity of food therefore has a major influence on quality of life. Research on feeding behavior focuses on the underlying processes that ensure actual feeding and unravels the role of factors regulating internal energy homeostasis and the neuronal bases of decision-making. The model organism Drosophila melanogaster, with its great variety of genetically traceable tools for labeling and manipulating single neurons, allows mapping of neuronal networks and identification of molecular signaling cascades involved in the regulation of food intake. This report demonstrates the CApillary FEeder assay (CAFE) and shows how to measure food intake in a group of flies for time spans ranging from hours to days. This easy-to-use assay consists of glass capillaries filled with liquid food that flies can freely access and feed on. Food consumption in the assay is accurately determined using simple measurement tools. Herein we describe step-by-step the method from setup to successful execution of the CAFE assay, and provide practical examples to analyze the food intake of a group of flies under controlled conditions. The reader is guided through possible limitations of the assay, and advantages and disadvantages of the method compared to other feeding assays in D. melanogaster are evaluated.
Introduction
אכילה היא חיונית; עם זאת, דה-רגולציה של צריכת המזון וכתוצאה מכך הפרעות אכילה כגון בולימיה, אנורקסיה או הנטייה הכללית לזלול מטילה עלויות על הפרט והחברה 1, 2, 3. מטרת המחקר הנוכחי היא לחשוף מנגנוני ויסות צריכת מזון ועל מנת לספק אסטרטגיה עקיפה היווצרות הפרעה. מחקרים רבים באמצעות אורגניזמים מודל יונקים סיפקו תובנות חדשות של המעגל ואת תפקידו של מערכות איתות הפרעות אכילה 4, 5, 6. עם זאת, הידע שלנו על הבסיסים העצבים מולקולריים שבבסיס הפרעות אלה עדיין רחוק מסיום. בשנים האחרונות, זבוב הפרות תסיסנית הפכה מערכת מודל ערך עבור נפרמי תובנה מכניסטית בסיסיות לתוך הסדרת metabolisמ 7, 8, 9. נימי מזין (CAFE) assay עבור תסיסנית הוקמה בשנת במעבדה של סימור Benzer בשנת 2007 בהשראת עבודה קודמת של Dethier ב blowfly 10, 11. את assay CAFE איפשר למדוד ישירות את צריכת המזון ב תסיסנית. במערכת מבחן התנהגותי זה, זבובי הניזונים מזון נוזלי מסופק נימי זכוכית מדורגות ממוקמות בתוך בקבוקון. הירידה של המניסקוס הנימים מציינת פסד של פתרון מזון באמצעות אידוי וצריכת מזון. קביעת שיעור האידוי על ידי בקבוקונים ללא זבובים מאפשר כימות מדויק של צריכת המזון.
את assay CAFE הוא אחד מכמה פרדיגמות התנהגותיים המשמשים למדידת האכלה תסיסנית וחוקרים צריכים לבחור את המתאים ביותר עבור הספציפיים שלהםשְׁאֵלָה. ההחלטה להשתמש assay מסוים כדאי לשקול את הנקודות הבאות: אופיו של המזון שמסר; תנאי ההאכלה; מדידת צריכה או ספיגת חומרים מזינות וצריכת מזון חקירה או תגובה למזון.
את assay CAFE כמתואר בדוח זה הנו אידיאלי עבור באי צריכת מזון של מקור מזון נוזלי תחת תנאי האכלה זקופים. לחלופין צריכת המזון ניתן למדוד עבור קבוצת זבוב על מקור מזון בצבע בבקבוקון או על צלחת. זבובים בדרך כלל נהרגים או בהרדמה לאחר ההאכלה והכמות לצבוע בליעה נקבעת על ידי ספקטרומטריית או בדיקה ויזואלית של הבטן המוכתמת. זבובים להתחיל להפריש האוכל לבלוע רק 30 דקות לאחר הצריכה, ולכן גישה זו קשה להשתמש לניתוח האכלה כבר רציפה התנהגויות 12, 13.
בניגוד זבובים נשמרים ללא פגע כאשר צבען נספגים עם קליעים נותבים רדיואקטיביים משמשים וצריכת רדיואיזוטופיים שלהם הוא הבקיע ב מונה הנצנץ 14, 15. הקליטה של radiolabel ידי מערכת העיכול זבוב עושה מדידה ספיגת מזון ארוכת טווח אפשרי, אבל עלול להוביל הערכה נמוכה מדי של בצריכה בגלל מולקולות נותב הלא נספג ומופרש. גישה נוספת למדוד בתגובת מזון תסיסנית היא התגובה הרחבה חוטם (PER), אשר מתרחשת בדרך כלל עבור צריכת מזון 16. שיטה אלגנטית זו מודדת את התגובה הראשונית לגירוי מזון אך אינו רושמת את הכמות צריכה. צריכת מזון מותאמת באופן דינמי במהלך האכלה באמצעות אותות משוב שלאחר עיכול מספר כי הם קריטיים עבור הסדרת ההאכלה 17, 18. מספר ניסיונות נעשו בשנים האחרונות לאוסף נתונים למחצה אוטומציה ב assay PER <sעד class = "Xref"> 19, 20. PER הוא זוהה על ידי כרית חשמלית או שילוב של אלקטרודות ומנה באמצעות מחשב. שילוב assay PER עם ספיגת רדיואיזוטופיים גילה כי assay זו מוגבלת על ידי רגישות נמוכה לזיהוי הבדלי האכלת כמות 18. את assay ההאכלה הידני (MAFE) 21, שבו זבוב מוזן באופן ידני עם נימי זכוכית, פותח לאחרונה למדוד ספיגת מזון זבוב משותק יחיד. את assay MAFE מבטל את ההתערבויות של ליקוט האכלת הייזום בעל רזולוצית זמן של שניות, וייזום PER וצריכת מזון ניתן לנטר באופן עצמאי ב assay. עם זאת, הדרך שבה חוסר תנועה של הזבוב משפיע על היבטים מסוימים של התנהגות אכילה (למשל תנועה, מוטיבציה) עדיין צריכה להיחקר. עבור ביקורות השוואתיות מעולות של מבחנים שונים למדידת צריכת מזון ב תסיסנית ליlanogaster וכדי לסייע לחוקרים למצוא את האדם המתאים ביותר, ראה דיווחי Deshpande ומרקס 13, 22.
את assay CAFE ימנע כמה מהחסרונות של מבחנים המתוארים לעיל ומשלב פשטות השימוש עם מדידה אמינה של צריכת מזון. כאן, תיאור מפורט של assay CAFE מסופק ואנחנו מראים שינוי התקנה פשוט להפחתת אידוי. נציג תוצאות כולל assay בחירת שני מזון (לזמן קצר ולזמן ארוך) ואת ספיגת סוכרוז זבובים מודגמות. בדיון נשווה השיטה המתוארת שלנו עם דרכים חלופיות כדי לבצע את assay CAFE, ולהאיר מגבלות פוטנציאליות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הדו"ח מתאר את assay CAFE בצורת צעד אחר צעד, תוך התמקדות ההגדרה הטכנית והביצועים מוצלחים במעבדה. בשל הפשטות שלה, assay זה יכול לשמש גם מבחינה חינוכית כניסוי ספר. הדוגמות מראות כי assay מאפשר חקירה של חישת מזון, העדפה וצריכה תסיסנית על פני תקופות זמן קצרות יותר (שעות עד ימי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the past and present members of the Scholz lab for discussion and Helga Döring for excellent technical support. We especially thank the members of the Biocenter workshop of the University of Cologne for their support and creativity. The work is supported by SFB 1340, SysMedAlc, and DAAD-Siemens.
Materials
| Vials (breeding) | Greiner Bio-One | 960177 | www.greinerbioone.com |
| Vials (CAFE assay) | Greiner Bio-One | 217101 | www.greinerbioone.com |
| Lid-CAFE assay | Workshop | – | – |
| Plastic box, low wall | Plastime | 353 | www.plastime.it |
| Cover for the plastic box | Workshop | – | – |
| Capillaries | BLAUBRAND | REF 7087 07 | www.brand.de |
| Pipette tips | Greiner Bio-One | 771290 | www.greinerbioone.com |
| Filter paper circles | Whatman | 10 311 804 | www.sigmaaldrich.com |
| D(+)-Sucrose | AppliChem | 57-50-1 | www.applichem.com |
| Ethanol absolute | VWR Chemicals | 20,821,330 | www.vwr.com |
| Food color (red, E124) | Backfun | 10027 | www.backfun.de |
| Food color (blue, E133) | Backfun | 10030 | www.backfun.de |
| Soap solution (CVK 8) | CVH | 103220 | www.cvh.de |
| Digital caliper | GARANT | 412,616 | www.hoffmann-group.com |
| Vials (breeding) | Height 9.8 cm, diameter 4.8 cm | ||
| Vials (CAFE assay) | Height 8 cm, diameter 3.3 cm | ||
| Lid-CAFE assay | Produced in university workshop, technical drawing supplied | ||
| Plastic box, low wall | A plastic grid inlay was custom-made for 8 x 10 vial positions | ||
| Cover for the plastic box | Dimensions (37 x29 x18 cm) | ||
| Capillaries | DIN ISO 7550 norm, IVD-guideline 98/79 EG, ends polished | ||
| Pipette tips | Pipettes for the outer circle are cut according to the lid | ||
| Filter paper circles | 45 mm diameter works nicely if folded for the vials used | ||
| D(+)-Sucrose | Not harmful | ||
| Ethanol absolute | Highly flammable liquid and vapor | ||
| Food color (red, E124) | Not stated | ||
| Food color (blue, E133) | Not stated | ||
| Soap solution (CVK 8) | Odor neutral soap | ||
| Digital caliper | |||
| Standard fly food | (for 20 L) | ||
| Agar | 160 g | ||
| Brewer`s Yeast | 299.33 g | ||
| Cornmeal | 1200g | ||
| Molasses | 1.6 L | ||
| Propionic acid | 57.3 mL | ||
| Nipagin 30% | 160 mL |
References
- Krauth, C., Buser, J., Vogel, K. How high are the costs of eating disorders – anorexia nervosa and bulimia nervosa – for German society. Eur. J. Health Econ. 3 (4), 244-250 (2002).
- Cawley, J., Meyerhoefer, C. The medical costs of obesity and instrumental variables approach. J. Health Econ. 31, 219-230 (2012).
- The costs of eating disorders: Social, health and economic impacts. Assessing the impact of eating disorders across the UK on behalf of BEAT. PwC Available from: https://www.beat.co.uk/assets/000/000/302/The_costs_of_eating_disorders_Final_original.pdf (2015)
- Lenard, N. R., Berthoud, H. R. Central and peripheral regulation of food intake and physical activity: pathways and genes. Obesity. 16, S11-S22 (2008).
- Magni, P., et al. Feeding behavior in mammals including humans. Trends in Comp. Endocrinology and Neurobiology. 1163, 221-232 (2009).
- Morton, G. J., Meek, T. H., Schwartz, M. W. Neurobiology of food intake in health and disease. Nature Reviews Neuroscience. 15, 367-378 (2014).
- Bharuchka, K. N. The epicurean fly: using Drosophila melanogaster to study metabolism. Pediatr. Res. 65 (2), 132-137 (2009).
- Smith, W. W., Thomas, J., Liu, J., Li, T., Moran, T. H. From fat fruit fly to human obesity. Physiol. Behav. 136, 15-21 (2014).
- Rajan, A., Perrimon, N. Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies. BMC Biology. 11, (2013).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Dethier, V. G. . The Hungry Fly: A Physiological Study of the Behavior Associated with Feeding. , (1976).
- Albin, S. D., Kaun, K. R., Knapp, J., Chung, P., Heberlein, U., Simpson, J. H. A subset of serotonergic neurons evokes hunger in adult Drosophila. Curr. Biol. 25, 2435-2440 (2015).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat. Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Geer, B. W., Olander, R. M., Sharp, P. L. Quantification of dietary choline utilization in adult Drosophila melanogaster by radioisotope methods. J. Insect Physiol. 16, 33-43 (1970).
- Thompson, E. D., Reeder, B. A., Bruce, R. D. Characterization of a method for quantitating food consumption for mutation assays in Drosophila. Environ. Mol. Mutagen. 18, 14-21 (1991).
- Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. Quantification of food intake in Drosophila. PLoS One. 4 (6), e6063 (2009).
- Scheiner, R., Steinbach, A., Classen, G., Strudthoff, N., Scholz, H. Octopamine indirectly affects proboscis extension response habituation in Drosophila melanogaster by controlling sucrose responsiveness. J. Insect Physiol. 69, 107-117 (2014).
- Liu, Y., Luo, J., Carlsson, M. K., Nässel, D. R. Serotonin and insulin-like peptides modulate leucokinin-producing neurons that affect feeding and water homeostasis in Drosophila. J. Comp. Neurol. 523, 1840-1863 (2015).
- Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila. PLoS One. 9 (6), e101107 (2014).
- Itskov, P. M. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behavior in Drosophila. Nat. Commun. 5, 4560 (2014).
- Qi, W., Yang, Z., Lin, Z., Park, J. Y., Suh, G. S. B., Wang, L. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Mol. Brain. 8, 87 (2015).
- Marx, V. Metabolism: feeding fruit flies. Nat. Methods. 12 (7), 609-612 (2015).
- Spieth, H. T. Courtship behavior in Drosophila. Annu. Rev. Entomol. 19, 385-405 (1974).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Preferential ethanol consumption in Drosophila models features of addiction. Curr. Biol. 19 (24), 2126-2132 (2009).
- Lee, K. P., et al. Lifespan and reproduction in Drosophila: New insights from nutritional geometry. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (7), 2498-2503 (2008).
- Pohl, J. B., et al. Ethanol preference in Drosophila melanogaster is driven by its caloric value. Alcohol Clin. Exp. Res. 36 (11), 1903-1912 (2012).
- Vargas, M. A., Luo, N., Yamaguchi, A., Kapahi, P. A role for S6 kinase and serotonin in postmating dietary switch and balance of nutrients in D. melanogaster. Curr. Biol. 20 (11), 1006-1011 (2010).
- Masek, P., Scott, K. Limited taste discrimination in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (33), 14833-14838 (2010).
- Pool, A. H., Scott, K. Feeding regulation in Drosophila. Curr. Opin. Neurobiol. 29, 57-63 (2014).
- Luo, J. N., Lushchak, O. V., Goergen, P., Williams, M. J., Nässel, D. R. Drosophila insulin-producing cells are differentially modulated by serotonin and octopamine receptors and affect social behavior. Plos One. 9 (6), e99732 (2014).
