זוהי שיטה ליצור פיגום תרבית תאים 3-ממדי תאי מטריקס ריאתי. ריאות שלמים מעובדות לתוך הידרוג שיכול לתמוך בצמיחה של תאים בשלושה ממדים.
כאן אנו מציגים שיטה לקביעת הידרוג תרבות רכיב תאים מרובה עבור תרבית תאי ריאות במבחנה. החל רקמת ריאה בריאה כמקשה אחת מן חזירי, חולדה או עכבר, הרקמה perfused ו שקוע דטרגנטים כימיים הבאים כדי להסיר את פסולת הסלולר. השוואת היסטולוגית של הרקמה לפני ואחרי עיבוד מאשרת הסרה מעל 95% של מכתים galactosidase דנ"א אלפא גדילים כפול מרמזת רוב פסולת הסלולר מוסר. לאחר decellularization, הרקמה lyophilized ואז cryomilled לאבקה. אבקת מטריקס מתעכלת במשך 48 שעות בתמיסת עיכול פפסין חומצי ולאחר מכן לנטרל כדי ליצור את פתרון pregel. Gelation של פתרון pregel יכול להיגרם על ידי דגירה על 37 מעלות צלזיוס, ניתן להשתמש מייד הנטרול הבא או מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבועות. ציפוי יכול להיווצר באמצעות הפתרון pregel על צלחת שאינם מטופלים עבור גמצורף ell. תאים יכולים להיות תלוי pregel לפני הרכבה עצמית כדי להשיג תרבות 3D, מצופה על פני השטח של ג'ל נוצר שממנו התאים יכולים להעביר דרך הפיגום, או מצופים על הציפויים. שינויים אל המתווה שהוצג יכול להשפיע טמפרטורה gelation, כוח, או בגדלים מקטעי חלבון. מעבר היווצרות הידרוג'ל, נוקשות הידרוג'ל ניתן להעלות באמצעות genipin.
Translating in vitro results to the clinic is one of the most challenging issues facing biomedical researchers. In vitro research on tissue culture plastic is easier, more convenient, and maintains high cell viability.1 This approach is a reasonable starting point, but the results have limited clinical translation. Increasingly, laboratories are incorporating three-dimensional constructs to replace the traditional two-dimensional methods. Reviews are available for many three-dimensional environments, from biological scaffolds to polymeric scaffolds.2,3
Biological frameworks can mimic characteristics of in vivo environments as they contain many of the protein and glycosaminoglycan components of the native matrix and provide familiar binding sites for cells to attach to and recognize. Extracellular matrix (ECM) derived materials have been shown to be capable scaffolds for cell attachment and proliferation.4 One challenge that limits the application of ECM hydrogel platforms stems from their inherently weak mechanical properties following gelation. Native tissue often has mechanical properties that are magnitudes higher than hydrogels. Non-toxic crosslinking agents can increase the mechanical properties of hydrogels to better mimic the native tissue environment. Genipin is a non-toxic, natural crosslinker derived from Gardenia plants with the ability to closely tailor mechanical properties of ECM with changes in genipin concentration5,6.
Nearly all cells in the body exist in, and organize on, ECM that they either produce or maintain. New focus on the universal importance of ECM in the organization, condition, and function in every organ or system has sparked the production of matrix based platforms for in vitro investigation. Porcine small intestine submucosa is the most extensively studied naturally-derived scaffold, and it has been used to regenerate tendons, ligaments, skeletal muscle4, and even bone7. Matrices from other organs and donor species have also demonstrated good tissue regeneration potential. The use of foreign ECM components causes minimal issues with immunomodulation. After elimination of host cellular matter, the remaining ECM will be similar in amino acid content and organization to all other mammalian species8. There is a growing line of thinking that the best way to examine cell-ECM interactions in vitro is to utilize organ-specific ECM scaffolds. Each organ provides a unique composition of proteins and proteoglycans to create cellular niches. Niches provide structural, functional and even the enzymatic breakdown of the extracellular matrix contributing to biophysical signaling. To attain an in vitro microenvironment most similar to the in vivo microenvironment, use of tissue specific ECM would optimize the cellular niches for research.
The goal of this protocol is to provide a method for establishing a hydrogel scaffold unique to the lung ECM. This method provides a platform for in vitro research on lung cell-ECM interactions.
אחד ההיבטים של ביולוגיה הנפרדים הוא הארגון-העצמי של מולקולות לתוך מבנים היררכיים לבצע משימה ספציפית. 13 במעבדה, הרכבה עצמית תלויה בגורמים רבים כגון ריכוז מלח, pH, ומשך העיכול. כפי שניתן לראות, נוצר הידרוג'ל מתארגנת מעצמה כאשר חלבונים solubilized לחזור לטמפרטורה פיזי?…
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות חוות סמית'פילד על תרומת רקמת הריאה החזירית ללא פגע. אנו רוצים גם להודות לד"ר הו יאנג, ד"ר כריסטינה טאנג והמחלקה לכירורגיה פלסטית VCU עבור ומאפשר לנו להשתמש בציוד שלהם. דגימות הידרוג'ל ורקמות הוכנו עבור SEM במחלקה לאנטומיה VCU מתקן מיקרוסקופית לנוירוביולוגיה נתמך, בין השאר, על ידי מימון NIH-NINDS מרכז Core גרנט 5 P30 NS047463 ו, בין השאר, על ידי טופס מימון גרנט תמיכה במרכז לחקר הסרטן NIH-NCI CA016059 P30. הדמיה SEM של דגימות במתקן אפיון Core ננוטכנולוגיה VCU (NCC). עבודה זו מומנה על ידי הקרן הלאומית למדע, CMMI 1,351,162.
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-100g | Use with eye protection and gloves. |
Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506-500g | None |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016-500g | None |
DNase | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | None |
HCl | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | Use with eye protection and gloves. |
Pepsin | Sigma-Aldrich | P6887-5G | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | Use with eye protection and gloves. |
Genipin | Wako Chemicals | 078-03021 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
PBS 10x | Quality Biological | 119-069-151 | None |
PBS | VWR | 45000-448 | None |
Filter Paper | Whatman | 8519 | N/A |
Hand pump | Fisher Scientific | 10-239-1 | N/A |
Graduate Beaker | VitLab | 445941 | N/A |
Cryomill | SPEX | 6700 | Use cryogloves and eye protection. |
Lyophilizer | FTS FlexiDry | Use gloves. | |
Rheometer | Discovery | HR-2 | Use gloves and eye protection. |