生理的酸素条件に曝露されたヒト細胞におけるキャップ結合タンパク質の解析
Summary
Here, we present human cell culture protocols to analyze translation initiation factors that bind the 5′ cap of mRNA during physiological oxygen conditions. This method utilizes an Agarose-linked m7GTP cap analog and is suitable to investigate cap-binding factors and their interacting partners.
Abstract
Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex is by far the most common pathway to initiate protein synthesis in eukaryotic cells, but stress-specific variations of this complex are now emerging. Purifying cap-binding proteins with an affinity resin composed of Agarose-linked m7GTP (a 5′ mRNA cap analog) is a useful tool to identify factors involved in the regulation of translation initiation. Hypoxia (low oxygen) is a cellular stress encountered during fetal development and tumor progression, and is highly dependent on translation regulation. Furthermore, it was recently reported that human adult organs have a lower oxygen content (physioxia 1-9% oxygen) that is closer to hypoxia than the ambient air where cells are routinely cultured. With the ongoing characterization of a hypoxic eIF4F complex (eIF4FH), there is increasing interest in understanding oxygen-dependent translation initiation through the 5′ mRNA cap. We have recently developed a human cell culture method to analyze cap-binding proteins that are regulated by oxygen availability. This protocol emphasizes that cell culture and lysis be performed in a hypoxia workstation to eliminate exposure to oxygen. Cells must be incubated for at least 24 hr for the liquid media to equilibrate with the atmosphere within the workstation. To avoid this limitation, pre-conditioned media (de-oxygenated) can be added to cells if shorter time points are required. Certain cap-binding proteins require interactions with a second base or can hydrolyze the m7GTP, therefore some cap interactors may be missed in the purification process. Agarose-linked to enzymatically resistant cap analogs may be substituted in this protocol. This method allows the user to identify novel oxygen-regulated translation factors involved in cap-dependent translation.
Introduction
翻訳制御は、特に細胞ストレス1の期間中に、遺伝子発現の転写調節にも等しく重要なステップとして浮上しています。翻訳制御の焦点は、タンパク質合成の最初のステップは7-メチルに真核生物の開始因子4E（のeIF4E）の結合を伴う開始の律速段階（メートル7 GTP）のmRNA 2の5 'キャップであります。 eIF4EはeIF4A、RNAヘリカーゼ、およびeIF4Gを、他の翻訳因子と40Sは3リボソームの募集に必要な足場タンパク質を含んでeIF4Fという名前の三量体複合体の一部です。正常な生理的条件下では、mRNAの大半はキャップ依存性機構を介して翻訳されていますが、細胞ストレスの期間の下で人間のmRNAの約10％が1,4- intiationキャップ非依存性翻訳される可能性があり5'UTRを含まれています。キャップ依存性翻訳は、歴史的に同義語となっていますOUのeIF4Fで、しかし、eIF4Fのストレス固有のバリエーションが話題に5-8となっています。
様々な細胞ストレスはのeIF4E活性がラパマイシン複合体1（mTORC1）の哺乳類標的を介して抑制させます。このキナーゼは、その目標の一つ、4E結合タンパク質（4E-BP）の活性の増加をもたらすストレス、下損なわれる。非リン酸化4E-BPはのeIF4EとブロックのeIF4Gは、キャップ依存性翻訳9,10の抑制を引き起こすと相互作用する能力に特異的に結合します。興味深いことに、eIF4E2（または4EHP）という名前のeIF4Eのホモログは、おそらく、それがストレス媒介抑制を回避することができ、4E-BP 11のためのはるかに低い親和性を有します。確かに、最初は原因のeIF4G 12との相互作用の欠如への翻訳のリプレッサーとして特徴づけ、eIF4E2は、低酸素ストレス6,13の間にそれらの3 'UTR中のRNAの低酸素応答エレメントを含むmRNAの何百もの翻訳を開始します。この活性化IeIF4G3、RNA結合タンパク質モチーフ4、および低酸素誘導因子、低酸素eIF4F複合体を構成する（HIF）2α、またはeIF4F H 6,13との相互作用を介して達成秒。通常の条件下ではリプレッサーとして、eIF4E2はGIGYF2とZNF598 14と結合します。これらの複合体は、部分的には、アガロース結合M 7 GTPの親和性樹脂を介して同定されました。この古典的な方法15は、翻訳の分野における標準であり、最高の、最も一般的にプルダウンでキャップ結合複合体を単離するための技術を使用し、in vitroでの結合アッセイ16-19です。キャップ依存性翻訳機構の間に変化する部分6-8,13のように柔軟で適応浮上しているように、この方法は急速にストレス応答に関与する新規キャップ結合タンパク質を同定するための強力なツールです。いくつかの真核生物のモデル系は、このようなストレス応答のためeIF4E2ホモログを使用するように見えるようさらに、eIF4Fの変動は、広い意味を持っている可能性がシロイヌナズナ 20として、S.ポンベ 21は 、Dは 22 ショウジョウバエ 、およびCは 23 エレガンス 。
証拠は、eIF4Fの変動がストレス条件に厳密に限定されないが、通常の生理24に関与することを示唆しています。 （微小電極を介して測定）（キャピラリー端で）または組織内の組織への酸素供給は、脳25で2から6パーセントから変化し、肺26内の百分の3から12まで、腸27、4％でで3.5から6パーセント肝臓28、腎臓29内の7から12までパーセント、筋肉30で4％、および骨髄31で6から7パーセント。細胞およびミトコンドリアは、1.3％未満の酸素32を含んでいます 。これらの値は、細胞が日常的に培養される周囲の空気よりも低酸素状態に非常に近いです。これは、どのような以前に低酸素症特異的な細胞過程であると考えられたが、生理的環境の中で関連するかもしれないことを示唆しています。興味深いことに、eIF4FとeIF4F H </suP>積極的に生理学的な酸素または「physioxia」24に露出し、いくつかの異なるヒト細胞株におけるmRNAの異なるプールまたはクラスの翻訳開始に関与します。低酸素はまた、適切な胎児の発育33を駆動し、細胞は、一般physioxia 34においてより高い増殖速度、より長い寿命、より少ないDNA損傷の少ない一般的なストレス応答を持っています。したがって、eIF4F Hは、おそらく生理的条件下で、選択遺伝子の発現の重要な要因です。
ここでは、固定された生理的酸素条件や組織の微小環境の可能性が高い、より代表的であるダイナミック変動範囲内の培養細胞へのプロトコルを提供します。この方法の一つの利点は、細胞が低酸素ワークステーション内に溶解されることです。細胞溶解に低酸素細胞培養物からの遷移は、他のプロトコルで実行される頻度は明らかではありません。細胞は、多くの場合、最初の小さな低酸素培養器から除去されること酸素に対する細胞応答が速いようフォア溶解するが、酸素へのこの暴露は35（1または2分）生化学的経路に影響を与える可能性があります。特定のキャップ結合タンパク質が第2の基地との相互作用を必要とするか、またはメートル7 GTPを加水分解することができ、したがって、いくつかのキャップ相互作用は、精製プロセスにおいて見落とされる可能性があります。アガロース結合酵素耐性キャップ類似体には、このプロトコルで置換されていてもよいです。ここに記載の方法によりeIF4F HとeIF4Fの他のバリエーションの活性および組成を探ることは、細胞が生理的条件やストレス応答の際に利用する複雑な遺伝子発現機械に光を当てるます。
Protocol
Representative Results
Discussion
生理的酸素条件に曝露したヒト細胞中でのキャップ結合タンパク質の分析は、新規な酸素調節翻訳開始因子の同定を可能にすることができます。 mRNA又は他のキャップ結合タンパク質の5 'キャップのためのこれらの因子の親和性がm 7 GTP結合アガロースビーズへの関連の強さを測定することができます。この技術の一つの注意点は、それがタンパク質ポスト溶解のキャップ結合能を?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada and the Ontario Ministry of Research and Innovation.
Materials
| γ-aminophenyl-m7GTP agarose C10-linked beads | Jena Bioscience | AC-1555 | Agarose-linked m7GTP |
| 100 mm culture dish | Corning | 877222 | 10-cm culture dish |
| 150 mm culture dish | Thermofisher | 130183 | 15-cm culture dish |
| AEBSF Hydrochloride | ACROS Organics | A0356829 | AEBSF |
| Agarose Beads | Jena Bioscience | AC-0015 | Agarose bead control |
| Bromophenol Blue | Fisher | BP112-25 | Component of SDS-PAGE loading buffer |
| 1.5 mL Centrifuge Tubes | FroggaBio | 1210-00S | Used to centrifuge small volumes |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher | 1495970C | Used in culturing primary cells |
| Defined trypsin inhibitor | Fisher | R007100 | DTI |
| Dithiothreital | Fisher | BP172-25 | DTT |
| Epithelial cell medium (complete kit) | ScienCell | 4101 | Includes serum and growth factor supplements) |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | Component of SDS-PAGE loading buffer |
| 100 mM Guanosine 5'-triphosphate, 1 mL | Jena Bioscience | 272076-0251M | GTP |
| HCT116 colorectal carcinoma | ATCC | CCL-247 | Human cancer cell line |
| Human renal proximal tubular epithelial cells | ATCC | PCS-400-010 | HRPTEC |
| Hyclone DMEM/High Glucose | GE Life Sciences | SH30022.01 | Standard media for human cell culture |
| Hyclone Penicillin-Streptomycin solution | GE Life Sciences | SV30010 | Antibiotic component of DMEM |
| H35 HypOxystation | Hypoxygen | N/A | Hypoxia workstation |
| Igepal CA-630 | MP Biomedicals | 2198596 | Detergent component of lysis buffer |
| Monopotassium phosphate | Fisher | P288-500 | KH2PO4 |
| Potassium chloride | Fisher | P217-500 | KCl |
| Magnesium chloride | Fisher | M33-500 | MgCl2 |
| Sodium chloride | Fisher | BP358-10 | NaCl |
| Sodium fluoride | Fisher | 5299-100 | NaF (phosphatase inhibitor component of lysis buffer) |
| Disodium phosphate | Fisher | 5369-500 | Na2HPO4 |
| Premium Grade Fetal Bovine Serum | Seradigm | 1500-500 | FBS |
| Protease Inhibitor Cocktail (100 x) | Cell Signalling | 58715 | Component of lysis buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-100 | SDS |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | 56508 | Na3VO4 |
| Tris Base | Fisher | BP152-5 | Component of buffers |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 2500-067 | Trypsin used to detach adherent cells |
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