生理氧条件下人细胞中帽结合蛋白的分析

摘要

本文介绍了在生理氧浓度条件下分析结合mRNA 5'端帽子结构的翻译起始因子的人源细胞培养方案。该方法利用琼脂糖偶联的m⁷GTP帽类似物，适用于研究帽结合因子及其相互作用分子。

摘要

转录后调控是基因表达调控的关键环节，尤其在细胞应激期间尤为重要。通过eIF4F复合物介导的帽依赖性翻译是真核细胞启动蛋白质合成最主要的途径，但目前正发现该复合物在特定应激条件下的变异形式。利用与琼脂糖偶联的m⁷GTP（一种5' mRNA帽子类似物）亲和树脂纯化帽结合蛋白，是鉴定参与翻译起始调控因子的有效工具。缺氧（低氧）是一种在胚胎发育和肿瘤进展过程中常见的细胞应激状态，其过程高度依赖于翻译调控。此外，最近有研究报道，人类成体器官的氧含量（生理氧水平为1–9%氧气）低于常规细胞培养所用的空气氧浓度，更接近于缺氧状态。随着对缺氧型eIF4F复合物（eIF4F^H）的持续表征，人们对通过5' mRNA帽子结构理解氧依赖性翻译起始机制的兴趣日益增加。我们近期建立了一种人源细胞培养方法，用于分析受氧气可及性调控的帽结合蛋白。本方案强调，细胞培养和裂解步骤必须在缺氧工作站中进行，以避免接触氧气。为使液体培养基与工作站内气氛充分平衡，细胞至少需孵育24小时。若需更短时间点，可使用预先平衡的去氧培养基（预处理培养基）以克服此限制。某些帽结合蛋白需要与第二个碱基相互作用，或能够水解m⁷GTP，因此在纯化过程中可能遗漏部分帽结合分子。本方案中可替换为与酶抗性帽类似物偶联的琼脂糖树脂。该方法可帮助研究者鉴定参与帽依赖性翻译的新型氧调控翻译因子。

引言

转录后调控在基因表达中正逐渐被视为与转录调控同等重要的环节，尤其在细胞应激期间尤为显著¹。翻译调控的关键环节在于起始阶段这一限速步骤，蛋白质合成的初始过程涉及真核起始因子4E（eIF4E）与mRNA 5'端的7-甲基鸟苷（m⁷GTP）帽子结构的结合²。eIF4E是名为eIF4F的三聚体复合物的一部分，该复合物还包括RNA解旋酶eIF4A和支架蛋白eIF4G，后者在招募其他翻译因子及40S核糖体过程中发挥必需作用³。在正常的生理条件下，绝大多数mRNA通过依赖帽子结构的机制进行翻译；但在细胞应激期间，约有10%的人类mRNA含有5'非翻译区（UTR），可能支持不依赖帽子结构的翻译起始^1,4。传统上，依赖帽子结构的翻译与eIF4F复合物被视为同义，然而，应激条件下eIF4F的特异性变体已成为当前研究热点^5-8。

多种细胞应激会通过雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）抑制eIF4E的活性。该激酶在应激条件下功能受损，导致其下游靶标之一——4E结合蛋白（4E-BP）的活性增强。非磷酸化的4E-BP可结合eIF4E，阻断其与eIF4G的相互作用，从而抑制帽依赖性翻译^9,10。有趣的是，eIF4E的一个同源蛋白eIF4E2（又称4EHP）与4E-BP的亲和力显著较低¹¹，这可能使其逃避应激介导的抑制作用。事实上，....

方案

1. 细胞培养的准备工作

1. 购买市售的人源细胞株。
   注意：本实验方案使用 HCT116 结肠直肠癌细胞和原代人肾近端小管上皮细胞（HRPTEC）。
2. 配制 500 ml HCT116 细胞培养用培养基：高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM），添加 7.5% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素（P/S）。
3. 配制 500 ml HRPTEC 细胞培养用培养基：上皮细胞培养基，添加 5% FBS、1% 上皮细胞生长补充剂和 1% 青霉素/链霉素（P/S）。
4. 配制 500 ml 1×磷酸盐缓冲液（PBS）：140 mM NaCl、3 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄、15 mM KH₂PO₄。调节 pH 至 7.4，并在 121 °C 下高压灭菌 40 分钟。

2. 细胞培养的启动

1. 小心吸出培养皿中80-90%汇合度的培养基，注意不要扰动细胞。
2. 每个培养皿中加入 3-5 ml 1×PBS，轻轻摇晃培养瓶以润洗培养皿表面，然后小心吸除 1×PBS。重复上述操作进行第二次 1×PBS 洗涤。
3. 将3 ml 0.05%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）分装至各培养皿中，轻轻摇动使胰蛋白酶-EDTA均....

结果

利用m⁷GTP亲和柱分析eIF4E和eIF4E2在不同氧浓度下的帽结合能力

图1和图2展示了两种主要帽结合蛋白在两种人源细胞系中响应氧气浓度变化的典型m⁷GTP亲和纯化结果的Western印迹图：图1为原代人肾近端小管上皮细胞（HRPTEC），图2为结直肠癌细胞（HCT116）。细胞在指定的氧气条件下培养24小时，以确保培养液中溶解的氧气与低氧工作站内的气体充分平衡。输入泳道（IN）代表加入m⁷GTP偶联琼脂糖 beads 前，全细胞裂解液的10%上样量。该输入泳道用作基准，以评估目标蛋白在m⁷GTP下拉实验中的富集程度。GTP泳道为使用1 mM GTP洗脱的m⁷GTP beads 洗脱液，此步骤可用于检测那些也能识.......

讨论

在生理性氧浓度条件下分析人细胞中的帽结合蛋白，有助于鉴定新型的氧调控翻译起始因子。这些因子与mRNA 5'端帽子结构或其他帽结合相关蛋白的亲和力，可通过其与m⁷GTP偶联琼脂糖微珠的结合强度来测定。该技术的一个局限性在于，它检测的是细胞裂解后蛋白的帽结合潜能，但实验在非变性条件下进行，能够维持蛋白质-蛋白质相互作用以及翻译后修饰（PTMs）。多个蛋白质-蛋白质相互作用介导了eIF4E家族与mRNA 5'端帽子结构的结合。4E-BP通过与eIF4E结合并阻断其与eIF4G的相互作用，从而抑制eIF4E功能，阻止43S前起始复合物的招募³⁸。eIF4E/4E-BP复合物仍结合于mRNA 5'端帽子结构上，抑制该转录本的翻译起始，因此可在m⁷GTP亲和层析中作为eIF4E活性被抑制的标志。相反，eIF4E在m⁷GTP柱上与eIF4G的结合则可作为活跃翻译起始的标志。翻译后修饰（PTMs）是调控翻译起始因子活性的另一机制。例如，Mnk1对eIF4E的磷酸化可增强其与mRNA 5'端帽子结构的亲和力³⁹。干扰素刺激基因15（ISG15）编.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
γ-氨基苯基-m7GTP 琼脂糖 C10-偶联微珠	Jena Bioscience	AC-1555	琼脂糖偶联的 m7GTP
100 mm 培养皿	Corning	877222	10 cm 培养皿
150 mm 培养皿	Thermofisher	130183	15 cm 培养皿
AEBSF 盐酸盐	ACROS Organics	A0356829	AEBSF
琼脂糖微珠	Jena Bioscience	AC-0015	琼脂糖微珠对照
溴酚蓝	Fisher	BP112-25	SDS-PAGE 上样缓冲液组分
1.5 ml 离心管	FroggaBio	1210-00S	用于离心小体积样品
15 ml 锥形离心管	Fisher	1495970C	用于原代细胞培养
确定型胰蛋白酶抑制剂	Fisher	R007100	DTI
二硫苏糖醇	Fisher	BP172-25	DTT
上皮细胞培养基（完整试剂盒）	ScienCell	4101	包含血清和生长因子添加剂
甘油	Fisher	BP229-1	SDS-PAGE 上样缓冲液组分
100 mM 鸟苷-5'-三磷酸，1 ml	Jena Bioscience	272076-0251M	GTP
HCT116 结肠直肠癌细胞	ATCC	CCL-247	人源癌细胞系
人肾近端小管上皮细胞	ATCC	PCS-400-010	HRPTEC
Hyclone DMEM/高糖	GE Life Sciences	SH30022.01	人细胞培养的标准培养基
Hyclone 青霉素-链霉素溶液	GE Life Sciences	SV30010	DMEM 中的抗生素组分
H35 HypOxystation	Hypoxygen	N/A	低氧工作站
Igepal CA-630	MP Biomedicals	2198596	裂解缓冲液中的去垢剂组分
磷酸二氢钾	Fisher	P288-500	KH2PO4
氯化钾	Fisher	P217-500	KCl
氯化镁	Fisher	M33-500	MgCl2
氯化钠	Fisher	BP358-10	NaCl
氟化钠	Fisher	5299-100	NaF（裂解缓冲液中的磷酸酶抑制剂组分）
磷酸氢二钠	Fisher	5369-500	Na2HPO4
优质胎牛血清	Seradigm	1500-500	FBS
蛋白酶抑制剂混合物（100 倍）	Cell Signalling	58715	裂解缓冲液组分
十二烷基硫酸钠	Fisher	BP166-100	SDS
正钒酸钠	Sigma	56508	Na3VO4
Tris 碱	Fisher	BP152-5	缓冲液组分
0.05% 胰蛋白酶-EDTA（1 倍）	Life Technologies	2500-067	用于解离贴壁细胞的胰蛋白酶