脂肪来源的基质细胞可能适用于利用患者自体细胞构建新组织。本文介绍一种分离具有增强成骨潜能的人脂肪来源基质细胞（ASCs）亚群的实验方案，随后将这些细胞应用于 体内 颅骨愈合实验
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本文内容
摘要
摘要
侵袭性癌症、严重创伤和感染可能导致骨缺损，其尺寸过大，无法利用患者自体现有的骨骼进行重建。体外生长骨组织的能力 从头合成 使用患者自身的细胞可利用充足的组织修复骨缺损，同时避免取用自体骨组织所带来的并发症。人们关注将脂肪来源的基质细胞（ASCs）作为组织工程的细胞来源，因为这些细胞可从患者自身的脂肪组织中大量获取。然而，ASCs 是一类异质性细胞群体，其中某些亚群在此类应用中可能比其他亚群更具效能。分离出成骨能力最强的 ASCs 亚群，有望提高骨组织工程过程的效率与效果。本方案中，ASCs 来源于人类供体的皮下脂肪组织。通过流式细胞术（FACS）分离出表达 BMPR-IB 标记物的 ASCs 亚群。随后将这些细胞应用于 体内 颅骨缺损修复实验显示，这些细胞与未分选细胞相比，具有增强的成骨再生潜能。
引言
由于创伤、感染或侵袭性癌症导致的大段骨缺损，对患者的康复和生活质量具有显著影响。现有技术可利用患者自体其他部位的健康骨骼来填充这些缺损，但这种移植方式本身会带来并发症风险和额外的病损负担1,2,3。此外，某些缺损过大或结构过于复杂，难以获得足够的供体骨进行填充。假体装置是填充骨缺损的另一种潜在选择，但其存在多种缺点，包括感染风险、假体材料失效以及异物反应等4。
基于这些原因，人们高度关注利用患者自体细胞构建生物性骨替代材料的可能性5。脂肪来源的基质细胞（ASCs）在这一应用中具有潜力，因为它们在患者自身的脂肪组织中来源丰富，并已被证明能够通过生成新的骨组织来修复骨缺损6,7。ASCs 是一类异质性的细胞群体，多项研究表明，筛选特定的细胞表面标志物可获得成骨活性增强的细胞群体8,9。选择成骨潜能最高的 ASCs 将提高接种了这些细胞的支架材料成功再生大段骨缺损的可能性....
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方案
注意：样本取自已签署知情同意书的患者。所有实验方案均已通过斯坦福大学机构审查委员会的审查和批准。 处理人体组织和细胞时，必须始终遵守所在机构规定的生物安全二级（BSL2）防护措施。
1. 试剂的准备
- 配制FACS缓冲液：将10 mL胎牛血清（FBS）、5 mL泊洛沙姆188（Poloxamer 188）和5 mL青霉素-链霉素（Pen-Strep）加入500 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中。
- 配制消化液：将0.375 g C. hemolyticum II型胶原酶粉末和5 mL泊洛沙姆188（Poloxamer 188）加入500 mL无菌199/EBSS培养基中。
- 配制标准培养基：将50 mL胎牛血清（FBS）和5 mL青霉素-链霉素（Pen-Strep）加入500 mL杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium）中。
2. 获取与分离脂肪来源干细胞（ASCs）
注意：确保已获得使用人体组织和分离人体干细胞所需的充分机构批准。从接受择期吸脂手术的健康供体获取腹部、侧腹或大腿皮下脂肪。将脂肪保存在塑料吸脂罐中。
- 按1:1比例向原始塑料罐中的脂肪中加入无菌PBS。（若脂肪体积为500 mL，则加....
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结果
手术当天进行的微型CT扫描将清晰显示颅骨缺损。此时，在4 mm的缺损区域尚无组织长入。随后在不同时间点获取扫描图像，以相对于基线量化缺损大小随时间的变化。接种BMPR-IB+细胞的缺损区域应比BMPR-IB-细胞和未分选细胞显示出更快的缺损闭合（图5）。此外，含有缺损的颅骨部分可经脱钙处理，并采用标准方法制备组织学切片12。使用Movat五色染色法染色的切片将显示，与其它细胞群体相比，经BMPR-IB细胞处理的缺损区域骨再生程度更高（图6）。
图1：PBS洗涤后的脂肪抽吸物。
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讨论
方案中的关键步骤
在收获ASCs时，关键步骤是使用胶原酶对脂肪进行充分消化。消化不充分将导致ASCs的得率降低。在对BMPR-IB+细胞进行FACS分选时，准确定义阳性门控范围至关重要。门控范围设置过宽可能导致分选出的细胞群体纯度不足。在制作颅骨缺损模型时，关键是要将缺损部位钻透颅骨骨质，但不得深入至硬脑膜。否则将引起大量出血并暴露脑组织，从而需要对动物实施安乐死。
修改与故障排除
关于颅骨缺损手术的麻醉，我们实验室倾向于使用吸入式异氟烷，但另一种选择是腹腔注射含有终浓度为10 mg/mL氯胺酮和1 mg/mL赛拉嗪的生理盐水混合物。该混合物的标准剂量为每30 g小鼠300 µL。此方法可提供约30分钟可靠的麻醉效果，且手术过程中无需将小鼠置于异氟烷鼻罩中。使用注射麻醉的缺点在于，一旦完成注射便无法再调整剂量。相比之下，吸入式异氟烷可在术中实时灵活调节剂量高低。
将细胞悬液加入支架时，研究人员可能会发现液体体积过小，在30分钟孵.......
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披露
作者无任何披露事项。
致谢
C.D.M. 获得了美国外科医师学会（ACS）住院医师研究奖学金的支持。M.S.H. 获得了加州再生医学研究所（CIRM）临床研究员培训基金 TG2-01159 的支持。M.S.H.、H.P.L. 和 M.T.L. 获得了美国颌面外科医师学会（ASMS）/颌面外科医师基金会（MSF）研究资助奖的支持。H.P.L. 获得了美国国立卫生研究院（NIH）基金 R01 GM087609 以及 Ingrid Lai 和 Bill Shu 为纪念 Anthony Shu 捐赠的资助。H.P.L. 和 M.T.L. 获得了 Hagey 儿科再生医学实验室和Oak基金会的支持。M.T.L. 获得了美国国立卫生研究院（NIH）基金 U01 HL099776、R01 DE021683-01 和 RC2 DE020771 的支持。D.C.W. 获得了美国国立卫生研究院（NIH）基金 1K08DE024269、Hagey 儿科再生医学实验室以及斯坦福大学儿童健康研究所教师学者奖的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100 微米细胞筛 | Falcon | 352360 | |
| 15 号手术刀片 | Miltex | 4-515 | |
| 24 孔板 | Corning | 3524 | |
| 40 微米细胞筛 | Falcon | 352340 | |
| 50 mL 圆锥形离心管 | Falcon | 352098 | |
| 6-0 Ethilon 尼龙缝线，18"，P-3 针头 | Ethicon | 1698G | |
| 抗 BMPR-IB 一抗 | R&D systems | FAB5051A | |
| BioGel PI 外科手套 | Mölnlycke Health Care | ALA42675Z | |
| 缓释型布托啡诺 | ZooPharm | ||
| Castro-Viejo 缝合针持 | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| CD1 裸鼠 | Charles River | 086 | |
| II 型胶原酶粉末 | Gibco | 17101-015 | |
| DMEM 培养基 | Gibco | 10564-011 | |
| 钻头：4.0 mm 环形刀 | Xemax Surgical | CK40 | |
| 钻头：Z500 无刷微型电机 | NSK | NSKZ500 | |
| FBS | Gibco | 10437-077 | |
| Fisherbrand 吸水垫，20" × 24" | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Fisherbrand 无菌棉纱布垫，4" × 4" | Fisher Scientific | 22-415-469 | |
| 加热垫 | Kent Scientific | DCT-20 | |
| Hyclone 199/EBSS 培养基 | GE Life Sciences | SH30253.01 | |
| Isothesia 异氟烷 | Henry Schein | 050033 | |
| 带齿微型镊 | Roboz | RS-5150 | |
| 带齿微型镊 | Roboz | RS-5150 | |
| 石蜡膜（Parafilm） | Bemis | PM996 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| 青链霉素双抗（Pen-Strep） | Gibco | 15140-122 | |
| PLGA 支架 | 专有配方 | ||
| 泊洛沙姆 188，10% | Sigma | P5556-100ML | |
| 带衬里无菌手术单，18" × 24" | Busse Hospital Disposables | 696 | 裁剪出适当尺寸的矩形开口 |
| 多聚蔗糖溶液：Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | |
| 聚维酮碘消毒液 | Medline | MDS093944H | |
| Puralube 石蜡油眼膏，1/8 盎司管装 | Dechra Veterinary Products | ||
| 红细胞裂解缓冲液 | Sigma | 11814389001 | |
| Webcol 酒精消毒棉片 | Covidien | 6818 |
参考文献
- Silber, J. S., et al. Donor site morbidity after anterior iliac crest bone harvest for single-level anterior cervical discectomy and fusion. Spine (Phila Pa 1976). 28 (2), 134-139 (2003).
- Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E. Bone substitutes: a....
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重印与许可
