Summary

פיתוחו של פרוטוקול מעודן עבור השתלת Subretinal טרנס-scleral של תאי אפיתל הפיגמנט ברשתית האנושי בעיניים עכברוש

Published: August 12, 2017
doi:

Summary

הזרקת subretinal הוחל נרחב במחקרים פרה של טיפול בתאי גזע חלופי עבור ניוון מקולרי הקשור לגיל. במאמר זה דמיינו, נתאר טכניקה הזרקת subretinal פחות מסוכן, הדירים בדיוק ששונתה באמצעות הגישה הטרנס-scleral להעביר תאים לתוך עיניו חולדה.

Abstract

מחלות רשתית ניווניות כגון הקשורות לגיל ניוון מקולרי (AMD) הן הגורם המוביל של אובדן ראייה בלתי הפיך ברחבי העולם. AMD מאופיין על ידי ניוון תאים (RPE) אפיתל הפיגמנט ברשתית, אשר הם טפט של תאים פונקציונלית ותמיכה אנטומית לעטוף עצביים ברשתית. טיפולי תרופתי הנוכחי AMD שאינו neovascular (AMD יבש) רק להאט את התקדמות המחלה, אך לא ניתן לשחזר את החזון, המחייב מחקרים שמטרתם זיהוי אסטרטגיות טיפוליות מקוריות. החלפת תאי RPE ניוונית עם תאים בריאים מביאות הבטחה להתייחס AMD יבש בעתיד. מחקרים מקיפים פרה של תאי גזע החלפת טיפולים ל- AMD לערב את השתלת תאי RPE נגזר תאי גזע לתוך מרחב subretinal של דגמים בעלי חיים, שבו מוחל על טכניקת ההזרקה subretinal. הגישה תכוף במחקרים אלה בעלי חיים פרה היא דרך המסלול טרנס-scleral, אשר נעשית קשה על ידי חוסר של פריט חזותי ישיר של הסוף מחט יכול לעיתים קרובות לגרום נזקים ברשתית. גישה חלופית דרך הזגוגיות מאפשר התבוננות ישירה של העמדה קצה המחט, אבל זה סיכון גבוה של טראומות כירורגיים כמו רקמות העין יותר נגרמת הפרעה. פיתחנו פחות מסוכן לשחזור ששונה הזרקה טרנס-scleral שיטה המשתמשת המחט מוגדר זוויות ועומקי בהצלחה ובעקביות לספק תאי RPE לחלל subretinal חולדה, למנוע פגיעה ברשתית מוגזמת. תאים מועברים באופן זה הוכחו בעבר בתמימותה בחולדה המלכותי המנתחים (RCS) לפחות 2 חודשים. טכניקה זו יכולה לשמש לא רק עבור השתלת תא, אלא גם עבור משלוח של מולקולות קטנות או בטיפולים גנטיים.

Introduction

הרשתית האנושית ממוקם בירכתי הפונקציות העין כמו רקמה חושית אור, משחק תפקיד קריטי בתפיסה חזון. תפקוד לקוי של תאים ברשתית או מוות של תאים ולכן גורם בעיות ראייה או עיוורון תמידי. הפרעות ניוון או תפקוד לקוי של התאים בשכבות השונות של הרשתית ידועים כמו מחלות רשתית ניווניות, ביניהם AMD הוא הסוג הנפוץ ביותר הגורם המוביל לעיוורון בלתי הפיך אצל הקשישים במדינות המפותחות 1,2. תהליך פתולוגי של AMD מזוהה עם הצטברות “drusen” בין השכבה RPE הקרום של ברוך הבסיסית, אשר בתורו פוגע RPE תמיכה של פיזיולוגיה קולט אור, המוביל ניוון רשתית עצבי הראייה הפסד3, 4,5. עד כה, אין שום תרופה לקבלת מתקדם יבש AMD (שאינם neovascular). הופעתה של טיפול בתאי גזע כמו פרדיגמה חדשה ב רפואה רגנרטיבית מביא את התקווה של החלפת תאי RPE לקוי או מת עם תאי גזע-derived תאים בריאים. ואכן, מחקרים מקיפים פרה של משתילים גזע תאים (למשל, תאי גזע עובריים אנושיים)-תאי RPE נגזר לתוך מודלים RPE-ניוונית היית בביצוע6,7, אשר חלקם התקדמו אל ניסויים קליניים8,9 (NCT01344993, ClinicalTrials.gov). לאחרונה, מקור חלופי של תאי גזע תושב בשכבה RPE האנושי, תאי הגזע האנושי RPE (hRPESCs), זוהה על ידי המעבדה שלנו ומשמש כיום במחקרים פרה של טיפול השתלת תאים (hRPESC-RPE) נגזר-RPE hRPESC ל- AMD 10 , 11 , 12 , 13.

טכניקת הזרקת subretinal מוחל במחקרים פרה שהוזכרו לעיל על ידי קבוצות מרובות, כולל הקבוצה שלנו. ישנן שתי גישות כלליות להזרקה subretinal בבעלי חיים: טרנס-vitreal, טרנס-scleral. הגישה הטרנס-vitreal יש את היתרון של המנתח היכולת לצפות ישירות בקצה המחט כפי שזה חודר העין הקדמי, חוצה את החלל כולו vitreal סמוכים על העדשה, חודר הרשתית מאחור את העין כדי להגיע את subretinal מקום14,15,16. עם זאת, זה דורש שיבוש הרשתית בשני מיקומים (anterior ואת אחורי), נושאת את הסיכון של פגיעה העדשה והיא יכולה לגרום בתוך זרם אחורי של תאים לתוך הזגוגיות כאשר המחט “ניתק”. לעומת זאת, הגישה הטרנס-בסקלרה, בעקרון, מונע מעורבות של הרשתית, הזגוגיות, ויוצא זרם אחורי העין. בחולדות פיגמנט, המנתח יכול לצפות בתחילה חדירה בסקלרה, אבל לאחר המעבר לתוך דמית פיגמנט, בקצה המחט אינה גלויה. ללא התבוננות ישירה, פורצים הרשתית נפוץ, עלול לגרום הקרע ברשתית ואספקה של תאים ו/או דם לתוך הזגוגיות. יתר על כן, כי השטח העין עקום, זה מאוד קשה לדעת איזה זוויות המחט ועומקי יעילים ביותר לזריקות טרנס-scleral.

במאמר זה דמיינו, אנחנו מציגים את שיטת הזרקת subretinal טרנס-scleral הודיע על ידי שימוש הערכות לאחר ניתוח עם אופטי טומוגרפיה קוהרנטיות (אוקטובר), אשר מאפשר בדיקה מקיפה של ההזרקה. הטכניקה שלנו הזרקה טרנס-scleral מנצל במיקומים מוגדרים, זוויות, בעומק של מחטים הזרקת לייצר טראומה כירורגי נמוך מאוד, אמינות גבוהה. כאן, במיוחד נדגים ההזרקה של תאי hRPESC-RPE לחלל subretinal של העכברוש RCS, דגם פרה-קליניים של AMD אנושי. בשיטה זו זריקה, בהצלחה ובעקביות נמסר לנו תאים hRPESC-RPE לחלל subretinal RCS עיניו חולדה עם שיעור הצלחה גבוה מאוד. הזרקה של תאי נמצאה בעבר את התוצאה שימור RCS photoreceptors לפחות 2 חודשים לאחר הזרקת13. הליך זה מבוצע תחת המיקרוסקופ ויבתר והוא קל ללמוד. זה דורש שני אנשים (מנתח ועוזר) כדי לבצע את הזריקה, הזמן הממוצע של הזרקת עבור כל בעל חיים הוא פחות מ-5 דקות. זוויות מוגדר ועומקי מחטים הזרקת מאפשרים עבור מעבדות, איפה OCT אינה זמינה להשיג הזרקת subretinal מוצלח. הוא מאפשר גישה subretinal מאוד לשחזור, יכול לשמש לא רק עבור השתלת תא, אלא גם עבור טיפולים תרופתיים משלוח וג’ין.

Protocol

בכל ההליכים הכרוכים חיות אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC)-המדינה באוניברסיטת ניו יורק באולבני. 1. הזרקת טרום הכנה הכנת השעיה תא hRPESC-RPEהערה: כל השלבים הבאים מבוצעות בתרביות רקמה סטרילי הוד, היכרות עם סטרילי טכניקה בסיסית נדרשת. ב?…

Representative Results

שימוש בטכניקה המתוארת במאמר זה, אנחנו בעקביות נמסר hRPESC-RPE תאים לחלל subretinal של חולדות RCS על ידי שליטה בדיוק את מיקום, זווית ועומק של החדרת מחט מזרק לתוך הרקמה (איור 1B-D ). מיד בוצעה ההשתלה הבאים, בדיקת OCT להתבונן ההזרקה, את bleb subretinal שנוצרו על-ידי התאים המושתלים….

Discussion

טכניקת הזרקת subretinal המתואר במאמר זה היא באמצעות מסלול טרנס-scleral, שבו מחט מזרק חודר השכבות החיצוניות (sclera-שכבה דמית-RPE קומפלקס) של הקיר העין ללא פגיעה עצבית ברשתית או מטריד את חלל בזגוגית. גישה טרנס-vitreal חלופי יש סיכון פוטנציאלי של העדשה נזק המוביל קטרקט, מאז עדשה של מכרסמים שוכן הרוב של חלל בזג…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנחנו רוצים להודות לפטי לדרמן על הסיוע על הניתוח, סוזן בורדן להכנה תאי RPE. אנו גם להכיר NYSTEM C028504 לצורך מימון לפרויקט זה. ג’סטין ד מילר נתמך על-ידי NIH הענק F32EY025931.

Materials

0.25% Trypsin-EDTA (1x) Life Technologies 25200-072
DNAse I Sigma DN-25
1xDulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Calcium & Magnesium (1xDPBS-CMF) Corning Cellgro 431219
Sterile Balanced Salt Solution (BSS) Alcon 00065079550
Sterile eye wash Moore Medical 75519
Sterile 0.9% saline Hospira 488810
Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%) Akorn 17478026312
Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%) Bausch & Lomb 24208058559
Phenylepherine Ophtalmic Solution, USP (10%) stock Bausch & Lomb 42702010305 This is used to make 2.5% Phenylepherine
Buprenex Patterson 433502
Dexamethasone APP Pharmaceuticals 63323051610
100% Ethanol Thermo Scientific 615090040
70% Ethanol Ricca Chemical Company 2546.70-5
Sterile GenTeal Lubricant Eye Gel Novartis 78042947
Sterile Systane Ultra Lubricant Eye Drops Alcon 00065143105
hRPESC-RPE cells Not available commercially Please refer to "Reference #12" for cell isolation and mainteinance.
24-well plates Corning 3526
Conical tubes (15 ml) Sarstedt 62554002
Microcentrifuge cap with o-ring LPS inc L233126
Capless Microcentrifuge tubes (1.7 ml) LPS inc L233041
Centrifuge Eppendorf 5804R
Sterile alcohol wipe McKesson 58-204
Sterile cotton tip applicators McKesson 24-106-2S
Sterile Weck-Cel spears Beaver-Visitec International  0008680
Sterile surgical drapes  McKesson 25-515
Gauze McKesson 16-4242
Nanofil syringe (10 ul) World Precision Instruments Nanofil
Nanofil beveled 33-gauge needle World Precision Instruments NF33BV-2
Insulin syringe needles 31-gauge Becton Dickinson 328418
Rat toothed forceps World Precision Instruments 555041FT
Vannas Micro Dissecting Spring Scissors Roboz RS-5602
Circulating water T pump  Stryker TP700
Heating pad Kent Scientific TPZ-814
Animal anesthesia system World Precision Instruments EZ-7000
Balance Ohaus PA1502
Stereo microscope Zeiss Stemi 2000
Microscope light source Schott ACE series
Bioptigen Envisu Spectral Domain Ophthalmic Imaging System Bioptigen R2210
Sterile black marker pen Viscot Industries 1416S-100
Miniature measuring scale Ted Pella Inc 13623
Infrared Basking Spot Lamp  EXO-TERRA PT2144 This is used as a heating lamp for animals during the post-surgical recovery  phase

References

  1. De Jong, P. T. Age-related macular degeneration. N Engl J Med. 355, 1474-1485 (2006).
  2. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
  3. Ambati, J., Fowler, B. J. Mechanisms of agerelated macular degeneration. Neuron. 75, 26-39 (2012).
  4. Abdelsalam, A., Del Priore, L. V., Zarbin, M. A. Drusen in age-related macular degeneration: Pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression. Surv Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).
  5. Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W. Age-related macular degeneration. N Engl J Med. 358 (24), 2606-2617 (2008).
  6. Lund, R. D., et al. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).
  7. Vugler, A., et al. Embryonic stem cells and retinal repair. Mech Dev. 124 (11-12), 807-829 (2007).
  8. Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
  9. Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt’s macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
  10. Stanzel, B. V., et al. Human RPE Stem Cells Grown into Polarized RPE Monolayers on a Polyester Matrix Are Maintained after Grafting into Rabbit Subretinal Space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
  11. Blenkinsop, T. A., et al. Human adult retinal pigment epithelial stem cell-derived RPE monolayers exhibit key physiological characteristics of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7085-7099 (2015).
  12. Salero, E., et al. Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
  13. Davis, J. R., et al. Human RPE Stem Cell-Derived RPE Preserves Photoreceptors in the Royal College of Surgeons Rat: Method for Quantifying the Area of Photoreceptor Sparing. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (5), 304-309 (2016).
  14. Westenskow, P. D., et al. Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension. J Vis Exp. (95), e52247 (2015).
  15. Lopez, R., et al. Transplanted Retinal Pigment Epithelium Modifies the Retinal Degeneration in the RCS Rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (3), 586-588 (1989).
  16. Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina. J Vis Exp. (84), e50932 (2014).
  17. Nair, G., et al. Effects of Common Anesthetics on Eye Movement and Electroretinogram. Doc Ophthalmol. 122 (3), 163-176 (2011).
  18. McGill, T. J., et al. Transplantation of human central nervous system stem cells – neuroprotection in retinal degeneration. Eur J Neurosci. 35, 468-477 (2012).
  19. Al-Hussaini, H., Kam, J. H., Vugler, A., Semo, M., Jeffery, G. Mature retinal pigment epithelium cells are retained in the cell cycle and proliferate in vivo. Mol Vis. 14, 1784-1791 (2008).
  20. Wang, S., Lu, B., Wood, P., Lund, R. D. Grafting of ARPE-19 and Schwann Cells to the Subretinal Space in RCS Rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (7), 2552-2560 (2005).
  21. Fabian, R. J., Bond, J. M., Drobeck, H. P. Induced corneal opacities in the rat. Br J Ophthalmol. 51 (2), 124-129 (1967).

Play Video

Cite This Article
Zhao, C., Boles, N. C., Miller, J. D., Kawola, S., Temple, S., Davis, R. J., Stern, J. H. Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes. J. Vis. Exp. (126), e55220, doi:10.3791/55220 (2017).

View Video