Bu protokol, aynı zamanda, bir polimer matrisi üzerinden bir ilacın difüzyon hızını belirlemek için kullanılabilir chemoattractants yanıt olarak hücre göçü ölçmek için özelleştirilebilir yöntemi göstermektedir.
Hücre göçü bağışıklık tepkilerinin, büyüme ve yara iyileşmesi önemli bir parçasıdır. Hücre göçü hücreleri, hücre-dışı matris ve çözünen ve çözünmeyen bir kimyasal faktörleri (örneğin, Kemoattraktantlar) arasındaki etkileşimleri içeren karmaşık bir süreçtir. Bu Boyden Chamber tahlilinde, bir bölücünün iki tarafında hücre sayımı yolu ile çalışma gibi hücrelerin göçünü ölçmek için standart yöntemler. Bu teknikler kullanımı kolay; Bununla birlikte, farklı uygulamalar için çok az bir geometrik değişiklik vardır. Bunun aksine, mikroakışkan cihazlar çözünür faktörlerin, 1, 2 özelleştirilebilir konsantrasyon gradyanı hücre göçü için kullanılabilir. Ancak, Mikroakiskan tabanlı deneyleri yapma yöntemleri öğrenmek için zor olabilir.
Burada, kimyasal konsantrasyon gradyanı yanıt olarak hücre göçü ölçmek için hücre kültürü odaları oluşturmak için kolay bir yöntem tarif eder. Bizim cep mibütünleştirme oda yönteminin, çeşitli uygulamalar için, hücre göçü incelemek üzere farklı doğrusal konsantrasyon gradyanları oluşturabilir. Bu yöntem kullanımı nispeten kolaydır ve genellikle lisans öğrencileri tarafından gerçekleştirilir.
Mikrokanal odası iyi bir Petri kabı içine nihai mikrokanal odasının şeklinde bir akrilik insert yerleştirerek oluşturuldu. Bundan sonra, poli (dimetilsiloksan) (PDMS) ekin üzerine döküldü. PDMS sertleşmeye bırakıldı ve daha sonra da ekleme uzaklaştırılmıştır. Bu, herhangi bir arzu edilen şekil ya da boyutta kuyu oluşturulması için izin verdi. Hücreler, daha sonra mikrokanal odasına ilave edilebilir ve çözünebilir maddeler arzu edilen maddenin bir agaroz blok ıslatılmasıyla kuyu birine eklenebilir. Agaroz blok kuyu birine ilave edilir ve zaman atlamalı görüntüler hücre göçü miktarını belirlemek amacıyla mikrokanal odasının alınabilir. Bu yöntemin varyasyonları bu yöntem HIG yapmak, belirli bir uygulama için yapılabilirhly özelleştirilebilir.
In order for vital processes such as wound healing, immune responses, and embryonic development to occur, cell migration must take place. Cell migration involves the interaction between cells and neighboring cells, the extracellular matrix, and soluble chemical cues (attractants or repellants). As an example, in the process of wound healing, fibroblasts play an integral role in fibrogenesis and wound contraction, where the cells are recruited to the site of injury to synthesize collagen in order to form the extracellular matrix3. Numerous mechanisms behind the migration of fibroblasts to a wound site have been studied, and they include different mechanical, physical, electrical, and chemotactic factors4. Fibroblasts respond especially well to different concentration gradients of growth factors. These different growth factors work together to optimize tissue regeneration5. While observing the chemotactic response of fibroblasts to growth factor concentrations, one can study the pattern of directional migration of fibroblasts and how they orient themselves around physical obstacles in order to reach their destination. Therefore, the goals of this study were to first develop a system in which fibroblast growth could be tracked under guidance by physical barriers and to secondly model the growth of fibroblasts as they navigate through the system.
Currently, the Boyden chamber assay is the most widely used system to measure the migration of cells6. The Boyden chamber consists of a two-chamber multi-well plate where each well may contain medium with or without chemoattractants7. A filter membrane provides a porous interface between the two chambers in each well; this creates a barrier so that cells cannot pass through unless it is by active migration. Typically, for the Boyden chamber, a chemoattractant is added to the lower chamber, and the system is allowed to equilibrate to form a gradient between the upper and lower wells4. One problem with the Boyden chamber assay is that steep gradients end up forming along a single axis perpendicular with the surface of the membrane. This causes the difference in the chemoattractant concentration between the upper and lower wells to be a lower than what was originally expected. Due to this constraint, the Boyden chamber assay makes it hard to correlate specific cell responses with particular gradient characteristics, such as the slope and the concentration difference. Without these measurements, it is hard to study multi-gradient signal integration.
To address some of the constraints of the traditional Boyden chamber assay, microfluidic assays have been developed to form customizable concentration gradients1. Standard methods for creating microfluidic systems require clean rooms for lithographic techniques. These techniques can be difficult to learn especially in a standard classroom setting. Thus, we have designed a chamber system for measuring cell migration that can be made without using a clean room. Using our system, the wells of the assay can be adjusted to a preferred size, and a linear concentration gradient of customized slope can be produced. This allows for accurate measurement of chemotaxis from random movement. The design is an inexpensive and easy-to-use system to model cell growth in response to different chemical stimuli.
Bizim mikrokanal odası büyüme faktörleri ve kimyasal çekici yanıt olarak, hücre göçü hızının belirlenmesi ve bir polimer matristen bir ilacın difüzyon oranını ölçmek de dahil olmak üzere amacıyla, bir çok kullanılabilir. Hücrelerin büyümesine ve odanın bir ucunda, bir kemoatraktanttır yerleştirmek için mikrokanal bölmesini kullanmak mümkündür. Hücreler kemoatraktan yanıt olarak büyür ve hücre göçü, hücre göçü oranını belirlemek üzere analiz edilebilir zaman atlamalı gör…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar bu proje için finansman sağlamak için Clemson Üniversitesi Yaratıcı Sorgulama program ve NSF CBET1254609 kabul.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Sigma-Aldrich | 761036 | poly(dimethylsiloxane) 2-part kit including silicone elastomer base and silicone elastomer curing agent |
Acrylic Sheets | US Plastic | 44200 | |
Disposable Petri Dishes | Falcon | 25373-041 | |
Fluorescein isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | FD20s-100MG | |
Agarose, Type I, Low EEO | Sigma-Aldrich | A6013-100G | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Fisher Scientific | 11965092 | Cell media components |
Fetal Bovine Serium | Fisher Scientific | 16000036 | Cell media components |
Penicillin-streptomycin | Fisher Scientific | 15140148 | Cell media components |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP24384 | |
EVOS XL Cell Imaging System | Thermo Fisher Scientific | AME3300 | Instrument used for taking time-lapse images |
Versa LASER | Universal Laser Systems, Inc. | Model number VLS2.30 | Laser cutter used for cutting plastic |