Мультимеру-PAGE: метод для захвата и Разрешающая белковых комплексов в биологических образцах
Summary
Представлен способ стабилизации и отделения нативных белковых комплексов из немодифицированного тканевого лизата с использованием реакционноспособного по аминогруппе белкового сшивающего агента, связанного с новой двухмерной системой электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE).
Abstract
Есть много хорошо разработанных методов для очистки и изучения одиночных белков и пептидов. Тем не менее, большинство клеточных функций осуществляется сетей взаимодействующих белковых комплексов, которые зачастую трудно исследовать, поскольку их связывания не является ковалентной и легко возмущается методами очистки. Эта работа описывает способ стабилизации и разделения нативные белковые комплексы из немодифицированной ткани с помощью двумерного электрофореза в полиакриламидном геле. Ткань лизат наносили на неденатурирующем сине-родной полиакриламидном геле, а затем электрический ток подается до тех пор, пока белок мигрирует на короткое расстояние в геле. Полоска геля, содержащая перенесенный белок затем вырезала и инкубировала с дитиобисом аминного реакционноспособным сшивающим реагентов (сукцинимидилпропионат), который ковалентно стабилизирует белковые комплексы. Полосы гель, содержащий поперечно-сшитые комплексы затем отливают в сульфат полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и третон комплексы разделены полностью. Метод основан на методах и материалах, знакомых большинству молекулярных биологов, это означает, что это недорогой и простой в освоении. В то время как он ограничен в своей способности адекватно отделить чрезвычайно крупные комплексы, и не было универсально успешным, метод был в состоянии захватить широкий спектр хорошо изученных комплексов, и, вероятно, применимо ко многим системам, представляющим интерес.
Introduction
Нормальная клеточная функция зависит от белок-белковых взаимодействий , 1, 2. В результате болезнь человека часто отмечается возмущениями в сборке и поведении различных белковых комплексов 3. Способность характеризовать такие взаимодействия Поэтому крайне важно. Современные средства обнаружения этих взаимодействий требует очистки белков-мишеней, часто с последующим раскрывающихся их взаимодействующих партнеров. Обычная очистка осуществляется дифференциальным центрифугированием, осаждением и / или хроматографически 4. Эти методы требуют больших затрат времени, должны быть изменены для каждого белка-мишени, и часто приводят к низким выходам. Современные методы очистки включают слияние пептидных тегов белков – мишеней, а затем с помощью иммунопреципитации или экстракции на колонках с грузом шариков , связанных с молекулой захвата 5,«> 6. Хотя это является расширяемым для многих белков, это требует модификации последовательности мишени, что потенциально приводит к конструкции , которые отличаются по сродству для своих обычных партнеров связывания. Деликатный характер некоторых белок-белковых взаимодействий означает , что этот метод не может быть применят для многих сценариев. Кроме того, выпадающие анализы, используемые для сопоставления белок-белковых взаимодействий может не захватывать точную клеточную картину, из-за ограниченных степеней свободы и неместных уровней белка приманки.
В идеале, белковые комплексы могут быть обнаружены в их родных штатах, без необходимости очистки или тянуть вниз. Синий нативный электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ-БН) была разработана в качестве менее денатурирующего электрофореза альтернативы натрия додецилсульфата в полиакриламидном геле (SDS-PAGE), а также позволяет для разделения некоторых белков и комплексов из биологических образцов 7. Однако белки в BN-PAGE с отдельной на основе LARGE число переменных, включая размер, заряд, трехмерную структуру, и ассоциации с другими молекулами. Взаимодействие этих факторов часто приводит к совместному разделению белков, образованию агрегатов, и плохого разрешению полосы белка. Двумерный электрофорез нативной полиакриламидном геле устраняет некоторые, но не все из этих проблем 8.
Для того, чтобы обойти осложнения , связанные с нативным разделением, некоторые авторы используют аминные-реактивные сшивающие реагенты, такие как дитиобис (сукцинимидилпропионат) (DSP), чтобы захватить белковые комплексы в лизатах ткани 4. Эти обработанные лизаты могут быть затем денатурируют и разделяют с помощью ДСН-ПААГ, сохраняя при этом родной размер и состав белковых комплексов. Однако, так как поперечно-сшивающие реагенты реагируют на основе близости от одной молекулы к другой, а также белков в лизатах ткани имеет много степеней свободы, и может взаимодействовать стохастический, неспецифический фон крест-linking может быть высоким, особенно в концентрированных образцах. Это может привести к трудным для интерпретации результатов.
Здесь мы демонстрируют использование способа гибридного БН-PAGE / SDS-PAGE, названный мультимера-электрофорез в полиакриламидном геле (мультимер-PAGE), для разделения и обнаружения белковых агрегатов в сложных смесях. Первоначально, клеточный лизат суспендируют в полиакриламидном геле с помощью BN-PAGE. Лизат-содержащий гель затем подвергают взаимодействию с реагентом DSP сшивания. Псевдо-иммобилизованных и слегка разделенные на геле, белки гораздо реже реагируют неспецифически, а это означает фон кросс-линкер реакционная способность снижается. После сшивания, гель полосы вырезают и разделяли с помощью SDS-PAGE. Полученный гель затем могут быть проанализированы с помощью любых средств, обычно связанных с электрофорезом в полиакриламидном геле. Этот метод позволяет для разделения и обнаружения нативных белковых комплексов в лизате немодифицированной ткани, без необходимости дополнительной очистки или PULL-Дауп.
Protocol
Representative Results
Discussion
Белок-белковые взаимодействия являются важными для каждой задачи живых существ выполнять. Из-за этого, они являются предметом пристального внимания и исследования. Мультимер-страница представляет собой новый способ для захвата, разделения и анализа широкого спектра белковых комплек…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Поддерживается DA034783 NIH / NIDA. Мы благодарим Брайан А. Киллингера за техническую помощь с мультимерами-ПААГОМ.
Materials
| Chemicals | |||
| ε-Aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| Acrylamide | Acros Organics | 164855000 | Toxic. |
| Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution) | BioRad | 161-0148 | Toxic. |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| Anti rabbit IgG-HRP from goat | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Bicinchoninic acid assay kit | Thermofisher | 23225 | |
| Bis-tris | Sigma | B9754 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647 | |
| Butanol | Fisher Scientific | A399-1 | |
| Chemiluminescence substrate kit | ThermoFisher | 24078 | |
| Coomassie blue G-250 | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | Toxic. |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | D128-1 | |
| Dithiobis(succinimidylpropionate) | Thermo Scientific | 22585 | |
| Dry nonfat milk | LabScientific | M0841 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermofisher | 78430 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144SI-212 | For titration. Caustic. |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | For PVDF membrane activation. Toxic. |
| Monoclonal anti α-synuclein IgG from rabbit | Santa Cruz Biotechnology | sc-7011-R | |
| N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine | Sigma | T9281 | |
| N,N'-methylenebisacrylamide | Acros Organics | 16479 | Toxic. |
| NP40 | Boston Bioproducts | P-872 | |
| Polysorbate 20 (tween-20) | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Polyvinylidene fluoride transfer membranes | Thermo Scientific | 88518 | |
| Ponceau S | Sigma | P3504 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 88265 | |
| SDS solution (10% w/v) | BioRad | 161-0416 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | L37771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8) | BioRad | 161-0799 | |
| Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8) | BioRad | 161-0798 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| GE Imagequant LAS 4000 | GE Healthcare | 28-9558-10 | |
| ImageJ software | NIH | ||
| Synergy H1 microplate reader | BioTek | ||
| Gel Former + Stand | Biorad | ||
| Microfuge 22R centrifuge | Beckman Coulter | ||
| 2 mL dounce homogenizer | |||
| Vortex mixer | Fisher Scientific | ||
| Ultrasonic tissue homogenizer | Fisher Scientific | FB120220 |
References
- Alberts, B. The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
- Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes Dev. 14 (9), 1027-1047 (2000).
- Rual, J. F., et al. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature. 437 (7062), 1173-1178 (2005).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 59 (1), 94-123 (1995).
- Ho, Y., et al. Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry. Nature. 415 (6868), 180-183 (2002).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
- Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Beisiegel, U. Protein Blotting. Electrophoresis. 7 (1), 1-18 (1986).
- Killinger, B. A., Moszczynska, A. Characterization of alpha-Synuclein Multimer Stoichiometry in Complex Biological Samples by Electrophoresis. Anal Chem. 88 (7), 4071-4084 (2016).
- Newman, A. J., Selkoe, D., Dettmer, U. A new method for quantitative immunoblotting of endogenous alpha-synuclein. PLoS One. 8 (11), e81314 (2013).
- Wong, S. S. . Chemistry of protein conjugation and cross-linking. , (1991).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Tanford, C., Reynolds, J. A. Characterization of membrane proteins in detergent solutions. Biochim Biophys Acta. 457 (2), 133-170 (1976).
- Peters, K., Richards, F. M. Chemical cross-linking: reagents and problems in studies of membrane structure. Annu Rev Biochem. 46, 523-551 (1977).
- Lomant, A. J., Fairbanks, G. Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate). J Mol Biol. 104 (1), 243-261 (1976).
- Sun, F., et al. Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein complex II. Cell. 121 (7), 1043-1057 (2005).
- Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
