Kwantitatieve visualisatie van leukocytinfectiet in een muizenmodel van Fulminant-myocarditis door middel van lichte microscopie
Summary
Hier beschrijven we een microscopie-aanpak van lichte lakens om het cardiale CD45 + leukocyten infiltraat te visualiseren in een muizenmodel van aseptische fulminante myocarditis, die wordt geïnduceerd door de intratracheale difterie toxine behandeling van CD11c.DTR muizen.
Abstract
Fluorescentiemicroscopie (LSFM), in combinatie met chemische clearingprotocollen, is de gouden standaard geworden voor het analyseren van fluorescent gelabelde structuren in grote biologische proefpersonen, en is van toepassing op cellulaire resolutie. De constante verfijning van de onderliggende protocollen en de verbeterde beschikbaarheid van gespecialiseerde commerciële systemen maken ons in staat om de microstructuur van hele muisorganen te onderzoeken en zelfs de karakterisering van cellulaire gedrag in verschillende live-imaging benaderingen mogelijk te maken. Hier beschrijven we een protocol voor de ruimtelijke full-mount visualisatie en kwantificering van de CD45 + leukocytenpopulatie in ontstoken muisharten. De methode maakt gebruik van een transgene muisstam (CD11c.DTR) die recentelijk is aangetoond dat het een robuust, inducerend model is voor de studie van de ontwikkeling van fulminante fatale myocarditis, gekenmerkt door dodelijke hartritmestoornissen. Dit protocol omvat myocarditis inductie, intravitusAl antilichaamgemedieerde celkleuring, orgaanbereiding en LSFM met daaropvolgende computerondersteunde beeldbehandeling. Hoewel het voorgesteld is als een zeer aangepaste methode voor onze specifieke wetenschappelijke vraag, is het protocol de blauwdruk van een gemakkelijk verstelbaar systeem dat ook volledig andere fluorescerende structuren in andere organen en zelfs in andere soorten kan richten.
Introduction
Tijdens de evolutie van lichtmicroscopie verschenen er vele gespecialiseerde vormen, allemaal ontwikkeld om beperkingen in het visualisatieproces voor bepaalde exemplaren te minimaliseren. Een dergelijke methode is fluorescentiemicroscopie (LSFM) met lichte lak. Vooropgesteld in 1903 door Siedentopf en Zsigmondy 1 en het vinden van zijn eerste fundamentele biologische toepassingen in de vroege jaren negentig 2 , is LSFM uitgegroeid tot het meest krachtige microscopische hulpmiddel tot op heden voor het visualiseren van grote specimens, zoals intacte muisorganen, met een fluorescentie signaalresolutie Naar het cellulaire niveau. Vanwege deze voordelen, in combinatie met het potentieel voor live-celbeelden, noemden Nature Methods LSFM de "Method of the Year 2014 3. "
Zoals de naam suggereert, wordt de steekproefverlichting in een LSFM uitgevoerd door lichte lakens, die loodrecht op de as van de gebruikte doel f zijn gerichtOf emissie-licht collectie en daaropvolgende beeldvorming. Het lichtvel wordt gewoonlijk gegenereerd door middel van brede, gecollimeerde laserbundels met een cilindrische lens of door de snelle zijwaartse beweging van smalle, gefocusseerde laserstralen in slechts één horizontaal of verticaal vlak 4 , 5 . Op deze manier wordt alleen het brandpunt van de beeldende optica verlicht, typisch met een dikte van 1-4 μm. Bijgevolg worden voor het in het verlichtingsvlak geplaatste fluorescerende monster zowel de opwekking van verstrooid licht als de effecten van fotobladen uit gebieden boven of onder het brandpuntsvlak geëlimineerd of sterk onderdrukt 6 , 7 . Aangezien alle out-of-focus vliegtuigen niet worden verlicht, worden fotoboekeffecten in deze gebieden weggelaten. In tegenstelling tot standaard confocal- of multi-fotonmicroscopie zijn de paden van verlicht en uitgestraald licht van elkaar gescheiden, zodat de uiteindelijke beeldkwaliteit Het is niet afhankelijk van de perfecte focus van de excitatie lichtbundel door de doelstellingen. Afhankelijk van de onderliggende vraag is het dus mogelijk om doelstellingen met een enorm gezichtsveld (FOV) te gebruiken, zodat het grootste mogelijk gebied van het verlichte vliegtuig kan worden afgebeeld zonder dat onderdelen in de xy-richting bewegen.
In moderne LSFM-systemen wordt een fluorescerend beeld van de gegenereerde optische sectie vastgelegd op een zeer gevoelige lading-gekoppelde apparaat (CCD) of complementaire metalen oxide-halfgeleider (CMOS) camera's die het gehele gezichtsveld (FOV) kunnen verwerven In microseconden. Door het monster door het lichtblad te verplaatsen en door het verkrijgen van afbeeldingen bij gedefinieerde z-stappen, is het dus mogelijk om de volledige 3D-informatie van een monster in een redelijke hoeveelheid tijd 8 , 9 te verkrijgen, waardoor deze techniek van toepassing is op levende cellen Studies 10 ,Ass = "xref"> 11 , 12 .
Niettegenstaande, hoewel LSFM een snelle, gevoelige en fluorescentie-vriendelijke methode biedt, is lichtoverdracht door het monster nog steeds een belangrijk probleem, vooral wanneer grote biologische monsters het doel zijn voor een 3D-analyse. Lichte transmissie wordt kritisch aangepast door fysieke aspecten van absorptie en door licht verstrooiing bij interfaces van structuren met verschillende brekingsindexen 13 . Daarom, wanneer beeldvorming meerdere millimeters groot is, wordt LSFM meestal gecombineerd met clearingprotocollen om de monsters optisch transparant te maken. Deze technieken zijn gebaseerd op het idee om water uit het respectievelijke biologische weefsel te verwijderen en uit te wisselen met water- of (organisch) op oplosmiddel gebaseerde immersiemiddelen, die worden gekozen om de brekingsindexen van de specifieke doelweefselcomponenten nauwkeurig aan te passen. Als gevolg hiervan wordt laterale lichtverstrooiing geminimaliseerd, en alle golflengtenVan het licht kan veel efficiënter door het weefsel 13 passeren. In veel gevallen lijken biologische monsters op deze manier macroscopisch kristalhelder, waardoor LSFM kan worden uitgevoerd, zelfs op hele muisorganen, met behulp van lange werkafstand, lage vergrotingsdoelstellingen.
Hier presenteren we een voorbereidingsprotocol voor grootbeeldbeeldvorming in een lakvelmicroscoop (zie de tabel van materialen), die we hebben vastgesteld om het cellulaire hartinfarct te onderzoeken in een murine model van myocarditis 15 . CD11c.DTR muizen verdrijven de primaat difterie toxine receptor (DTR) onder de controle van de CD11c promotor 16 . Bijgevolg worden cellen in deze muizen die CD11c samen met de DTR uitdrukken gevoelig gemaakt voor het exotoxine van Corynebacterium difterie (difterietoxine, DTX); De systemische behandeling van deze dieren met DTX resulteert in een uitputting van alle CD11c + ceLLS. CD11c is een integrin en is als celoppervlakreceptor voor een verscheidenheid van verschillende oplosbare factoren betrokken bij activatie- en rijpingsprocessen, hoofdzakelijk in cellen van de monocytische lijn 17 . Bijgevolg is het CD11c.DTR muismodel intensief gebruikt om de rol van dendritische cellen en macrofaag subsets te bestuderen in het kader van vele verschillende immunologische vragen. Na verloop van tijd is gemeld dat CD11c.DTR-muizen die systemisch met DTX behandeld zijn, nadelige bijwerkingen kunnen ontwikkelen en sterk verhoogde sterftecijfers 18 , 19 kunnen weergeven. Onlangs konden we de onderliggende oorzaak van de dood identificeren 15 , waarin de ontwikkeling van fulminante myocarditis na de intratracheale DTX-toepassing in deze dieren werd beschreven. De toxine-uitdaging veroorzaakte cellulaire vernietiging, inclusief in de centrale delen van het stimulusoverdrachtssysteem in het hart. Dit ging gepaard met massale CD45+ Infiltratie van leukocyten, wat uiteindelijk leidt tot dodelijke hartritmestoornissen. In dit geval was niet alleen het uiterlijk van de leukocytenpopulatie belangrijk, maar ook de ruimtelijke verdeling in het hart. Deze experimentele vraag is een uitdaging voor moderne microscopische beeldvorming, die we hebben opgelost door middel van een microscopische aanpak van lichte lakens die wordt ondersteund door intravitale antilichamenverf en een optisch clearingprotocol op basis van organisch oplosmiddel.
Protocol
Representative Results
Discussion
In de moderne levenswetenschappen speelt de microscopische visualisatie van biologische processen een steeds belangrijker rol. In deze context zijn er in de laatste twee eeuwen veel ontwikkelingen gerealiseerd die bijdragen tot het beantwoorden van vragen die niet tot dit punt kunnen worden aangepakt. Ten eerste is er een duidelijke neiging geweest om het resolutie vermogen van lichtmicroscopen fundamenteel te vergroten. Met gestructureerde verlichtingsmicroscopie (SIM) 21 , <sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Onderzoek in het Gunzerlaboratorium werd ondersteund door het Duitse ministerie van Onderwijs en Onderzoek (subsidie nr. 0315590 AD) en door de Duitse Onderzoeksstichting (subsidie nr. GU769 / 4-1, GU769 / 4-2). We bedanken verder de IMCES voor technische ondersteuning en Sebastian Kubat voor hulp bij 3D-cartoonmodellen.
Materials
| diphtheria toxin | Sigma Aldrich | D0564 | |
| phosphate buffered saline | Biochrom | L182-10 | |
| ketamine [50 mg/ml] | Inresa | PZN 4089014 | |
| xylazine [2 %] | Ceva | ||
| syringe | Braun | REF 9161502 | Braun Omincan F |
| indwelt venous catheter | Becton Dickinson | REF 381923 | BD Insyte Autoguard |
| small animal respirator | Harvard Apparatus | 73-0044 | MiniVent |
| anit-CD45 antibody (AF647) | BioLegend | 103124 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.2 | |
| catheter (21 G) | BD Biosciences | REF 387455 | BD valu-set |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PE tube (5 ml) | Carl Roth | EKY9.1 | Rotilabo |
| ethanol | Carl Roth | 9065.4 | |
| dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014 | |
| tube rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | MACSmix |
| agarose (low gelling) | Sigma Aldrich | A4018 | |
| mold (15x15x5 mm) | Tissue Tek | 4566 | Cryomold |
| light sheet microscope system | LaVision Biotec | Ultramicroscope | |
| microscope body | Olympus | MVX10 | |
| objective | Olympus | 0.5 NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5 mm | |
| sCMOS camera 5.5MP | Andor Technology | ||
| 488 nm OPSL (50mW) laser | Coherent | ||
| 647 nm diode laser (50mW) | Coherent | ||
| 3D image processing & analysis software | Bitplane | IMARIS Ver. 8.3 | |
| transgenic mouse strain | Steffen Jung et al. | CD11c.DTR | |
| wt mouse strain | Envigo | Balb/c Ola Hsd J | |
| Laser Module | LaVision Biotec | ||
| MVPLAPO 2XC Objective Lens |
References
- Siedentopf, H., Uber Zsigmondy, R. Sichtbarmachung und Größenbestimmung ultramikoskopischer Teilchen, mit besonderer Anwendung auf Goldrubingläser. Annalen der Physik. 315 (1), 1-39 (1902).
- Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J. Microsc. 170 (Pt 3), 229-236 (1993).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs(1,2,3). eNeuro. 2 (3), (2015).
- Greger, K., Swoger, J., Stelzer, E. H. Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. Rev. Sci. Instrum. 78 (2), 023705 (2007).
- Keller, P. J., Stelzer, E. H. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (5), (2010).
- Becker, K., Jahrling, N., Kramer, E. R., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Ultramicroscopy: 3D reconstruction of large microscopical specimens. J Biophotonics. 1 (1), 36-42 (2008).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Taormina, M. J., et al. Investigating bacterial-animal symbioses with light sheet microscopy. Biol. Bull. 223 (1), 7-20 (2012).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. J. Am. Soc. Nephrol. , (2016).
- Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat. Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
- Schmid, B., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nat Commun. 4, 2207 (2013).
- Cella Zanacchi, F., et al. Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples. Nat. Methods. 8 (12), 1047-1049 (2011).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Maruyama, A., et al. Wide field intravital imaging by two-photon-excitation digital-scanned light-sheet microscopy (2p-DSLM) with a high-pulse energy laser. Biomed Opt Express. 5 (10), 3311-3325 (2014).
- Mann, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. 46 (8), 2028-2042 (2016).
- Jung, S., et al. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17 (2), 211-220 (2002).
- Corbi, A. L., Lopez-Rodriguez, C. CD11c integrin gene promoter activity during myeloid differentiation. Leuk. Lymphoma. 25 (5-6), 415-425 (1997).
- Zaft, T., Sapoznikov, A., Krauthgamer, R., Littman, D. R., Jung, S. CD11chigh dendritic cell ablation impairs lymphopenia-driven proliferation of naive and memory CD8+ T cells. J. Immunol. 175 (10), 6428-6435 (2005).
- Zammit, D. J., Cauley, L. S., Pham, Q. M., Lefrancois, L. Dendritic cells maximize the memory CD8 T cell response to infection. Immunity. 22 (5), 561-570 (2005).
- Hasenberg, M., Kohler, A., Bonifatius, S., Jeron, A., Gunzer, M. Direct observation of phagocytosis and NET-formation by neutrophils in infected lungs using 2-photon microscopy. J. Vis. Exp. (52), (2011).
- Bailey, B., Farkas, D. L., Taylor, D. L., Lanni, F. Enhancement of axial resolution in fluorescence microscopy by standing-wave excitation. Nature. 366 (6450), 44-48 (1993).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198 (Pt 2), 82-87 (2000).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie. 9 (1), 413-418 (1873).
- Göppert-Mayer, M. Über Elementarakte mit zwei Quantensprüngen. Annalen der Physik. 401 (3), 273-294 (1931).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Männ, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. , (2016).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Dirckx, J. J., Kuypers, L. C., Decraemer, W. F. Refractive index of tissue measured with confocal microscopy. J Biomed Opt. 10 (4), 44014 (2005).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat. Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS One. 10 (5), e0124650 (2015).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Shivapathasundharam, B., Berti, A. E. Transparent tooth model system. An aid in the study of root canal anatomy. Indian J. Dent. Res. 11 (3), 89-94 (2000).
- Karreman, M. A., et al. Fast and precise targeting of single tumor cells in vivo by multimodal correlative microscopy. J. Cell Sci. 129 (2), 444-456 (2016).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nat. Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
