Summary

Évaluation des cardiomyocytes types suivants Reprogrammation Transcription Factor médiée par des fibroblastes embryonnaires de souris

Published: March 22, 2017
doi:

Summary

This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.

Abstract

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs).

We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.

Introduction

Le cœur est le premier organe fonctionnel à se développer dans l'embryon 1, 2. En conjonction avec le système circulatoire, il fournit de l'oxygène, des nutriments, et un mécanisme d'élimination des déchets au cours du développement. Trois semaines après la fécondation, le cœur humain bat pour la première fois et sa réglementation appropriée est maintenue par cardiomyocytes (SGC). La perte irréversible de ces cellules spécialisées est donc la question fondamentale qui sous-tend l'insuffisance cardiaque progressive. Tandis que certains organismes , tels que le poisson zèbre et Xenopus ont un potentiel de régénération cardiaque, le cœur de mammifère adulte est plus limitée 3, 5, 6. Ainsi, compte tenu de la fonction critique du cœur, il est pas étonnant que la maladie cardiaque est la principale cause de décès dans le monde, ce qui représente 600.000 décès aux Etats-Unis seulement 7. lerefore, les thérapies à base de cellules pour réparer ou remplacer efficacement le myocarde blessés sont d'un grand intérêt clinique.

L'étude séminal Yamanaka et ses collègues 8 montré que l' expression forcée de quatre facteurs de transcription est suffisante pour transformer des cellules de fibroblastes complètement différenciées des cellules souches pluripotentes. Cependant, la capacité tumorigène de toutes les stratégies de cellules souches pluripotentes a été une préoccupation critique dans leur utilisation à des fins thérapeutiques. Ceci a motivé le domaine scientifique à la recherche de méthodes alternatives pour transdifférencier cellules tout en évitant une étape pluripotentes. Récemment, plusieurs groupes ont montré la faisabilité de cette stratégie en affichant la conversion directe de fibroblastes de souris aux cellules analogues à des cardiomyocytes induites (iCLMs) avec l'expression ectopique de facteurs de transcription Gata4, MEF2C, Tbx5, et plus tard, Hand2 (GMT et GHMT , respectivement) , 9, 10. Furthermore, la même stratégie peut être réalisée in vivo et dans des tissus d' origine humaine 9, 11, 12. Des études récentes ont mis en évidence des facteurs supplémentaires ou les voies de signalisation qui peuvent être modulées pour améliorer encore l' efficacité de reprogrammation cardiaque 13, 14, 15. Pris ensemble, ces études démontrent le potentiel de transdifférenciation dirigé pour les thérapies régénératrices. Cependant, la faible efficacité de CM reprogrammation, les mécanismes moléculaires inconnus, reproductibilité incompatibles en raison des différences méthodologiques 16, et de la nature hétérogène de iCLMs restent sans réponse.

Afin d'évaluer directement ICLM hétérogénéité, nous avons conçu un essai à cellule unique discrète et robuste pour l'identification du développement des sarcomères et cardiaque lignée specification-deux caractéristiques nécessaires de cardiomyocytes fonctionnels. Il y a au moins trois grands types de CM dans le coeur tel que défini par leur emplacement et les propriétés électriques uniques: auriculaire (AM), ventriculaire (VM) et pacemaker (PM) 17, 18, 19, 20. Dans une combinaison orchestrée, ils permettent le bon pompage du sang. Pendant les blessures du cœur, un ou tous les sous-types peuvent être affectés, et le type de thérapie cellulaire devraient être abordées au cas par cas. À l'heure actuelle, la plupart des stratégies axées sur la production globale de cardiomyocytes, alors que peu de travaux sont en cours pour étudier les mécanismes moléculaires qui régule la spécification de sous-type.

L'étude suivante détaille comment quantifier correctement sarcomères bien organisés et identifier un ensemble diversifié de sous-types de cardiomyocytes. L'utilisation d'un pacemaker (PM) souris rapporteur spécifique de, nous sommes en mesure d'appliquer un iapproche mmunocytochemical de distinguer les myocytes atriaux induites comme (IAM), les myocytes ventriculaires induites comme (IVM), et myocytes PM-like induits (IPMS) 21. Sur la base de nos observations, seules les cellules qui présentent l'organisation sarcomère sont capables de battre spontanée. Cette plate-forme de reprogrammation unique permet d'évaluer le rôle de certains paramètres dans l'organisation du sarcomère, la spécification du sous-type, et l'efficacité de CM reprogrammation à seule cellule de résolution.

Protocol

Toutes les procédures expérimentales impliquant des pratiques animales ont été approuvées par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle à l'UT Southwestern Medical Center. 1. Isolement de HCN4-GFP E12.5 souris embryonnaires fibroblaste (MEF) Mettre en place des accouplements chronométrés entre homozygotes mâles HCN4-GFP et CD-1 femelles. Sacrifiez femme enceinte à E12.5 par le dioxyde de carbone et l'euthanasie dislocation cer…

Representative Results

Profitant de la souris reporter PM-spécifique, nous avons développé une stratégie d'immunocoloration multiplex pour identifier divers myocytes endogènes comme le montre la figure 1. Après les étapes de reprogrammation de la figure 2, l' induction de CMs spécifiques du sous-type peut être détectée dès le jour 4 21, mais à un faible taux. Au jour 14, l'expérience peut être arrêté et évalué pour l' …

Discussion

La présente étude fournit une stratégie directe reprogrammation pour la conversion de MEFs dans un ensemble diversifié de sous-types cardiaques via l'expression de retrovirus de la transcription cardiaque Facteurs Gata4, MEF2C, Tbx5 et Hand2 (GHMT). En utilisant une approche d'immunocoloration multiplex en combinaison avec une souris reporter PM-spécifique, nous sommes en mesure d'identifier iAM, IVM, et IPMS à la résolution d'une seule cellule. Un tel essai permet une expérimentation dans</e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

A.F.-P. was supported by the National Science Foundation Graduate Research Fellowship under Grant No.2015165336. N.V.M was supported by grants from the NIH (HL094699), Burroughs Wellcome Fund (1009838), and the March of Dimes (#5-FY14-203). We acknowledge Young-Jae Nam, Christina Lubczyk, and Minoti Bhakta for their important contributions to protocol development and data analysis. We also thank John Shelton for valuable technical input and members of the Munshi lab for scientific discussion.

Materials

DMEM Sigma D5796 Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media
Medium 199 Thermo Fisher Scientific 11150059 Component of iCLM media
Fetal bovine serrum (FBS) Sigma F2442 Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media
Insulin-Transferrin-Selenium G Thermo Fisher Scientific 41400-045 Component of iCLM media
MEM vitamin solution Thermo Fisher Scientific 11120-052 Component of iCLM media
MEM amino acids Thermo Fisher Scientific 1601149 Component of iCLM media
Non-Essential amino acids Thermo Fisher Scientific 11140-050 Component of iCLM media
Antibiotic-Antimycotics Thermo Fisher Scientific 15240062 Component of iCLM media
B-27 supplement Thermo Fisher Scientific 17504044 Component of iCLM media
Heat-Inactivated Horse Serum Thermo Fisher Scientific 26050-088 Component of iCLM media
NaPyruvate Thermo Fisher Scientific 11360-70 Component of iCLM media
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 1514022 Component of Plat-E media and fibroblast media
Puromycin  Thermo Fisher Scientific A11139-03 Component of Plat-E media
Blasticidin   Gemini Bio-Products 400-128P Component of Plat-E media
Glutamax Thermo Fisher Scientific 35050-061 Component of Fibroblast media
Confocal laser scanning LSM700 Zeiss For confocal analysis
FuGENE 6 transfection Reagent Promega E2692 Transfection reagent 
Opti-MEM Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985-070 Transfection reagent 
Polybrene Millipore TR-1003-G Induction reagent. Use at a final concentration of 8um/mL
Platinium-E (PE) Retroviral Packagin Cell Line, Ecotropic CellBiolabs RV-101 Retroviral pacaking cell line
Trypsin 0.25% EDTA Thermo Fisher Scientific For MEFs and Plat-E dissociation
Mouse anti α-Actinin (Clone EA-53) Sigma A7811 Antibody for confocal analysis. Use at 1:200
Chicken anti-GFP IgY Thermo Fisher Scientific A10262 Antibody for confocal analysis. Use at 1:200
Rabbit Pab anti-NPPA  Abgent AP8534A Antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Rabbit Pab anti Myl2 IgG  ProteinTech 10906-1-AP Antibody for confocal analysis. Use at 1:200
Vectashield solution with DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Vector Labs H-1500 Dye for confocal analysis
Superfrost Plus Microscope slides Thermo Fisher Scientific 12-550-15 25 x 75 x 1.0 mm
BioCoat Fibronectin 12mm coverslips NeuVitro Corp GG-12-1.5 Coverslips for confocal analysis
100um cell strainer Thermo Fisher Scientific 08-771-19
0.45um Syringes filters SFCA 25MM Thermo Fisher Scientific 09-740-106 For virus filtration
6ml Syringes Covidien 8881516937 For virus filtration
Goat anti-Chicken IgY (H&L) A488 Abcam AB150169 Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Donkey anti-rabbit A647 IgG(H+L)  Thermo Fisher Scientific A31573 Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Goat anti-mouse IgG(H+L) A555 Thermo Fisher Scientific A21422 Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Triton X-100 Sigma 93443-100ml For cell permeabilization 
Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS) Sigma D8537
Power Block 10X Universal Blocking reagent Thermo Fisher Scientific NC9495720 Dilute to 1X in H20
16% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA) Electro Microscopy Sciences  15710 Use at 4% diluted in dH20
6 cm  plates Olympus 25-260
6-well plates Genesee Scientific 25-105
24-well plates Genesee Scientific 25-107
10 cm Tissue culture dishes Corning 4239
15 cm  Tissue culture dishes Thermo Fisher Scientific 5442
15 ml Conical tubes Corning 4308
50 ml Conical tubes Corning 4249
0.4% Trypan blue solution Sigma T8154 For viability
Ethyl Alcohol 200 proof Thermo Fisher Scientific 7005
Bleach Thermo Fisher Scientific 6009

References

  1. Sissman, N. J. Developmental landmarks in cardiac morphogenesis: comparative chronology. Am J Cardiol. 25 (2), 141-148 (1970).
  2. Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6 (11), 826-835 (2005).
  3. Ali, S. R., et al. Existing cardiomyocytes generate cardiomyocytes at a low rate after birth in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (24), 8850-8855 (2014).
  4. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  5. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
  6. Lin, Z., Pu, W. T. Strategies for cardiac regeneration and repair. Sci Transl Med. 6 (239), 239rv231 (2014).
  7. Writing Group, M., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).
  8. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  9. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
  10. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
  11. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).
  12. Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1 (3), 235-247 (2013).
  13. Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (38), 11864-11869 (2015).
  14. Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
  15. Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nat Commun. 6, 8243 (2015).
  16. Miki, K., Yoshida, Y., Yamanaka, S. Making steady progress on direct cardiac reprogramming toward clinical application. Circ Res. 113 (1), 13-15 (2013).
  17. Atkinson, A., et al. Anatomical and molecular mapping of the left and right ventricular His-Purkinje conduction networks. J Mol Cell Cardiol. 51 (5), 689-701 (2011).
  18. Bootman, M. D., Smyrnias, I., Thul, R., Coombes, S., Roderick, H. L. Atrial cardiomyocyte calcium signalling. Biochim Biophys Acta. 1813 (5), 922-934 (2011).
  19. Miquerol, L., Beyer, S., Kelly, R. G. Establishment of the mouse ventricular conduction system. Cardiovasc Res. 91 (2), 232-242 (2011).
  20. Später, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
  21. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
  22. Conner, D. A. . Current Protocols in Molecular Biology. , (2001).
  23. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
  24. Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (17), 8033-8037 (1993).
  25. Ichim, C. V., Wells, R. A. Generation of high-titer viral preparations by concentration using successive rounds of ultracentrifugation. J Transl Med. 9, 137 (2011).
  26. Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
  27. Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nat Commun. 5, 5807 (2014).
  28. Muraoka, N., Ieda, M. Direct reprogramming of fibroblasts into myocytes to reverse fibrosis. Annu Rev Physiol. 76, 21-37 (2014).
  29. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E., Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. . Retroviruses. , (1997).
  30. Bass, G. T., et al. Automated image analysis identifies signaling pathways regulating distinct signatures of cardiac myocyte hypertrophy. J Mol Cell Cardiol. 52 (5), 923-930 (2012).

Play Video

Cite This Article
Fernandez-Perez, A., Munshi, N. V. Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts. J. Vis. Exp. (121), e55456, doi:10.3791/55456 (2017).

View Video