En Face Vorbereitung der Maus Blutgefäße
Summary
Ein Verfahren zur Herstellung von Gesichtspräparaten der Kartoffel-Arterie und Aorta der Maus ist beschrieben. Solche Präparate, wenn sie mit spezifischen Antikörpern immunfluoreszenz gefärbt sind, ermöglichen es uns, die Lokalisation von Proteinen und die Identifizierung von Zelltypen innerhalb der gesamten Gefäßwand durch konfokale Mikroskopie zu untersuchen.
Abstract
Abschnitte von Paraffin eingebetteten Geweben werden routinemäßig für das Studium der Gewebe Histologie und Histopathologie verwendet. Es ist jedoch schwierig zu bestimmen, was die dreidimensionale Gewebemorphologie aus solchen Abschnitten ist. Darüber hinaus dürfen die untersuchten Abschnitte der Gewebe nicht die Region innerhalb des Gewebes enthalten, die für den Zweck der laufenden Studie notwendig ist. Diese letztere Begrenzung behindert histopathologische Untersuchungen von Blutgefäßen, da sich vaskuläre Läsionen fokalisiert entwickeln. Dies erfordert eine Methode, die es uns ermöglicht, eine breite Fläche der Blutgefäßwand von ihrer Oberfläche zu tieferen Regionen zu untersuchen. Ein ganzes Vorfeld der Vorbereitung der Blutgefäße erfüllt diese Anforderung. In diesem Artikel werden wir zeigen, wie man Vorbereitungen der Maus-Aorta und der Carotis-Arterie vorbereitet und sie immunofluoreszierend für konfokale Mikroskopie und andere Arten der fluoreszenzbasierten Bildgebung färbt.
Introduction
Für histopathologische Untersuchungen durch Lichtmikroskopie werden dreidimensionale Stücke biologischer Gewebe routinemäßig für die Paraffin-Einbettung verarbeitet, gefolgt von Schnitt und Färbung. Eine Gewebeprobe, die paraffineingebaut worden ist, kann in allen drei Dimensionen mehrere Millimeter betragen. Jedoch muss es zum Zwecke der Lichtmikroskopie zuerst geschnitten werden, so dass Licht durchlaufen und dann gefärbt werden kann, so dass der dünne Abschnitt genügend Kontrast für die Bildgebung ergibt. Da abgetrennte Proben üblicherweise 5-10 μm dick sind, sieht man nur einen sehr kleinen Bruchteil der gesamten Probe in zwei Dimensionen zu einer Zeit. Es ist möglich, sequentielle Abschnitte zu sammeln und nach der Bildgebung jedes Abschnitts einzeln eine computergestützte Rekonstruktion der 3D-Bilder durchzuführen, aber das ist ein langwieriger Job. Die Histopathologie der Blutgefäße, insbesondere für das Studium der Pathogenese der Atherosklerose, stellt einzigartige Probleme dar. Atherosklerose ist eine fokale Krankheit, die sich entwickeltLokal in Gebieten, in denen gestörter Blutfluss auftritt. Darüber hinaus wird die Krankheit innerhalb der Intima, ein dünnes Gewebe, bestehend aus einer Monoschicht von Endothelzellen und extrazelluläre Matrix, von großen Arterien initiiert. Aus diesen Gründen ist es eine Herausforderung, frühe Läsionen mit geschnittenen Blutgefäßen zu lokalisieren und zu studieren, weil man die Läsion leicht vermissen kann. Auch wenn ein Abschnitt einen kranken Bereich einschließt, sieht man nur einen 5-10 μm-Anteil, der Endothelzellen und andere vaskuläre Wandzellen in den Medien und Adventitia enthält.
Die ganze Aufmachung erlaubt es uns, ein weites Gebiet der Blutgefäßoberfläche zu übersehen, wie die gesamte Aorta von der Aortenwurzel bis hinunter zu den iliaca arterien. Unter Verwendung einer solchen Probe, die mit spezifischen Antikörpern und anderen spezifischen Sonden gefärbt ist, kann man die Lage von Läsionen lokalisieren und auch dort, wo verschiedene molekulare Ereignisse in Endothelzellen in Verbindung mit wi auftretenTh atherogenese wie Veränderungen in der Expression, Lokalisierung und posttranslationalen Modifikationen von Proteinen. Neben der Untersuchung der Atherogenese wird die in En-Face-Präparaten beobachtete endotheliale Zellform als Indikator für das regionale zeitlich gemittelte Blutflussmuster verwendet. Solche Daten sind wichtig für das Studium der Mechanosignierung von Endothelzellen in situ. Zu diesem Zweck sind routinemäßige histologische Querschnittsblutgefäße nicht sinnvoll. Für die Gefäßmedizin und die Biologie ist es daher besonders wichtig, eine Technik zur Herstellung von Gesichtspräparationen von Blutgefäßen zu erwerben, die es ermöglichen, einen weiten Bereich der Gefäßoberfläche sowie die tieferen Untergrundgebiete des Gefäßes zu beobachten.
Wie von Jelev und Surchev 1 überprüft, haben Gefäßbiologen verschiedene Methoden entwickelt, um die Auskleidung der Blutgefäße zu betrachten. In den 1940er und 1950er Jahren wurden einige geniale Methoden entwickelt. Mit diesen Methoden waren sie In der Lage, die grundlegende Organisation der endothelialen Zellen, die die innere Oberfläche der Blutgefäße Linie zu studieren. Wegen der Art und Weise, wie diese Vorbereitungen hergestellt werden (das sogenannte Hautchen-Verfahren 2 , 3 , 4 oder Abziehen der Gefäßoberfläche 5 ) und die Art und Weise, wie die Probe gefärbt wurde, war es nicht immer möglich, eine ununterbrochene morphologische zu erhalten Information von der Gefäßoberfläche in die tieferen Bereiche der Blutgefäßwand. Die gesamte Pflanze, die mit der Immunfluoreszenzfärbung kombiniert wurde, erlaubte uns, nicht nur die endotheliale Zellmorphologie und die Proteinexpression und die Lokalisierung in diesen Zellen zu untersuchen, sondern auch solche Untersuchungen an den subendothelialen Bereich der Gefäßwand zu erweitern. Frühe Studien mit Blutgefäß en Gesicht Vorbereitungen gefärbt immunoflurescently begann in den 1980er Jahren erscheinen ,F "> 7. Mit dem Aufkommen der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie und der jüngsten Multiphotonenmikroskopie kann man nun in den immunfluoreszenzgefärbten Gefäßproben sowie im Gefäßnetzwerk bei lebenden Tieren klare, fokussierte Bilder der Blutgefäßwandstruktur erhalten 8 , 9 , 10 , 11. Diese computerbasierten bildgebenden Verfahren erzeugen in-fokussierte optisch geschnittene Bilder, und durch Stapeln solcher Bilder kann man rekonstruierte 3D-Bilder der Gefäßwand und des Gefäßnetzwerks in Geweben erhalten Kann Bilder von einem Abschnitt erzeugen , der entlang der Z-Achse des rekonstruierten Bildes 12 , 13 gemacht wird .
In diesem Artikel werden wir eine Methode zur Vorbereitung von En-Face-Präparationen der Mausaorta und der Carotis-Arterie zur Immunfluoreszenz-Färbung veranschaulichen. En Gesicht VorbereitungenKann gemacht werden, auch nachdem diese Gefäße experimentell manipuliert worden sind. Zum Beispiel kann eine Carotis-Arterie teilweise ligiert werden und dann eine En-Gesicht Vorbereitung nach einer solchen Operation gemacht. Aus diesem Grund werden wir auch in diesem Artikel beschreiben, wie wir eine partielle Ligation an der Carotis-Arterie machen. Im Vergleich zu ähnlichen Vorbereitungen von größeren Tieren wie Ratten, Kaninchen und Menschen sind die Mausgefäße klein und zerbrechlicher und erfordern so eine zusätzliche Pflege für die Handhabung während der chirurgischen Isolierung von Gefäßen und deren Herstellung für die Antikörperfärbung und Mikroskopie. Weil das am häufigsten verwendete Tiermodell für die genetische Veränderung die Maus ist, wird es für viele Forscher kritisch, Mausgefäße zu behandeln, ohne sie zu beschädigen. In diesem Manuskript werden wir beschreiben, wie man mit den Maus-Blutgefäßen umgehen kann, wenn man Gesichtsvorbereitungen der Maus-Aorta und der Carotis-Arterie herstellt. Zum Zwecke der Demonstration verwenden wir Wildtyp C57 / b6 Mäuse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bei der Handhabung von Maus-Blutgefäßen ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass das Endothel zerbrechlich ist und dass jede übermäßige mechanische Kraft die Endothelzellen beschädigt. Zum Beispiel brechen oder lösen sich Endothelzellen von der Gefäßwand, wenn das Gefäß zu kräftig perfundiert wird, was leicht passieren kann, wenn das Gefäßsystem mit einer handbetriebenen Spritze perfundiert wird.
Um einen konstanten Perfusionsdruck zu erhalten, verwenden wir ein Schwerkraft…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Forschungsaktivitäten der Autoren werden durch Stipendien des Nationalen Instituts für Gesundheit an Dr. Abe (HL-130193, HL-123346, HL-118462, HL-108551) unterstützt.
Materials
| 0.9% Sodium Chloride injection solution USP 500ml bag | Fisher Scientific | NC9788429 |
| 12-well plates | Fisher Scientific | 12556005 |
| 6-0 coated vicryl suture | Ethicon | J833G |
| AF488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A11006 |
| AF546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11035 |
| Anti-CD144 (Ve-Cad) | BD Biosciences | BD555289 |
| Anti-VCAM-1 (H-276) Rabbit polyclonal IgG | Santa Cruze Biotechnology | Sc-8304 |
| Aoto Flow System | Braintree Scientific | EZ-AF9000 |
| Autoclave Wrap. 24x24in | Cardinal Health | 4024 |
| Blunt retractors, 2.5mm wide | Fine Science Tools | 18200-10 |
| Caprofen (Rimadyl) | zoetis | NADA#141-199 |
| Chlorhexidine Scrub, 2% | Med-Vet International | RXCHLOR2-PC |
| Curity gauze sponges 2×2 | Cardinal Health | KC2146 |
| Electric heating pad, 12X14 | Fisher Scientific | NC0667724 |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 |
| Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 |
| Micro cover glass 22x50mm | VWR | 48393059 |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-18 |
| normal goat serum | Equitech-Bio | GS05 |
| Paraformaldehyde Solution 4% in PBS | Santa Cruze Biotechnology | SC-281692 |
| Petri Dishes 100x15mm | Fisher Scientific | FB0875713 |
| Prolong Gold Antifade mountant with DAPI | Life Technologies | P-36935 |
| Puritan cortton swabs | VWR | 10806-005 |
| Puritan Mini cotton tipped aplicators | VWR | 82004-050 |
| Round handled Needle Holder | Fine Science Tools | 12076-12 |
| Silk Suture 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 |
| Spring scissors | ROBOZ | RS-5601 |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools | 14075-09 |
| Super Grip Forceps | Fine Science Tools | 00649-11 |
| Transparent Dressing | Cardinal Health | TD-26C |
| Triton X-1000 | Fisher Scientific | AC327371000 |
References
- Jelev, L., Surchev, L. A novel simple technique for en face endothelial observations using water-soluble media -‘thinned-wall’ preparations. J Anat. 212 (2), 192-197 (2008).
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