Imagerie in vivo de Transgenic Gene Expression en Retinal individuelle progéniteurs dans chimériques Zebrafish Embryons à étudier cellulaires Influences non autonomes

Summary

Suivi en direct des progéniteurs rétiniens WT individuels dans des contextes génétiques distincts permet l'évaluation de la contribution de la signalisation non-autonome cellule pendant la neurogenèse. Ici, une combinaison de knock – down de gènes, la génération par la transplantation d' embryons chimères et in vivo d' imagerie confocale time-lapse a été utilisé à cette fin.

Abstract

Les forces génétiques et techniques ont fait le vertébré zebrafish un modèle d'organisme clé dans lequel les conséquences des manipulations génétiques peuvent être retracées in vivo tout au long de la période de développement rapide. Plusieurs procédés peuvent être étudiés, y compris la prolifération cellulaire, l'expression des gènes, la migration cellulaire et la morphogenèse. Fait important, la production de chimères à travers la transplantation peut être effectuée facilement, ce qui permet l'étiquetage de la mosaïque et le suivi des cellules individuelles sous l'influence de l'environnement de l'hôte. Par exemple, en combinant manipulations fonctionnelles de gènes de l'embryon hôte (par exemple, par le biais de morpholino microinjection) et l' imagerie en direct, les effets de extrinsèque, des signaux non autonomes cellulaires (fournis par l'environnement génétiquement modifié) sur les cellules du donneur transplantées individuels peuvent être évalués. Ici, nous montrons comment cette approche est utilisée pour comparer l'apparition de l'expression du transgène fluorescent comme un proxy pour le moment du destin cellulaire détermination dans différents environnements d'accueil génétique.

Dans cet article, nous fournissons le protocole de micro – injection d' embryons de poisson zèbre pour marquer les cellules du donneur et pour provoquer knockdown de gènes dans des embryons hôtes, une description de la technique de transplantation utilisé pour générer des embryons chimériques, et le protocole pour la préparation et l' exécution in vivo time-lapse confocal imagerie de plusieurs embryons. En particulier, la réalisation d'imagerie multiposition est crucial lorsque l'on compare le calendrier des événements tels que l'apparition de l'expression génique. Cela nécessite la collecte de données de contrôle multiples et les embryons expérimentaux traités simultanément. Une telle approche peut être facilement étendu pour les études des influences extrinsèques dans un organe ou d'un tissu de choix accessible pour vivre l'imagerie, à condition que les transplantations peuvent être ciblés facilement selon les cartes du destin embryonnaires établies.

Introduction

La capacité à visualiser les processus de développement importants dans un vertébré in vivo a contribué à faire du zebrafish un modèle clé pour l' étude des conditions normales et pathologiques (revue en ^{1, 2).} En particulier, la rétine neurale est une partie accessible du système nerveux central. La rétine se prête à exécuter aisément des études de la neurogenèse en raison de sa très organisée, mais la structure relativement simple, et les types de neurones hautement conservées entre les espèces de vertébrés ^3. Dynamique des comportements cellulaires tels que la prolifération, la sortie du cycle cellulaire, la division cellulaire asymétrique, la spécification du destin, la différenciation et la formation des circuits neuronaux peuvent être suivis tout au long de l'ensemble du processus de rétinogenèse, qui est complétée dans la rétine centrale du poisson zèbre par 3 d post-fécondation ( dpf) ^{4, 5,}ref "> ^{6, 7.}

En outre, les exigences fonctionnelles des différents gènes dans chacune des étapes mentionnées ci-dessus peuvent être concomitantly évalués dans la rétine de poisson zèbre, fournissant un avantage sur les autres modèles vertébrés dans lequel phénotypes résultant de l'application des techniques de knock-out du gène ne peut être évaluée lors de l'examen post-mortem des tissus fixe. En particulier, l'utilisation de lignées transgéniques dans lesquelles nous pouvons visualiser et de contrôler l'expression de protéines fluorescentes comme transgènes rapporteurs dans la rétine, nous permet d'obtenir une résolution temporelle de l'expression des gènes qui sous-tend la genèse d'un type neuronal particulier de cellules. En raison du développement rapide de poisson-zèbre, ces événements peuvent être visualisés au cours de toute la période du développement, fournissant ainsi une connaissance plus approfondie de l'importance temporelle de l'expression des gènes en relation avec l'acquisition de l'identité de la cellule neuronale et le comportement des cellules.

Enfin, ces approches peuvent être combinées de manière efficace dans le poisson zèbre avec la génération d'une chimère via la transplantation, ce qui entraîne un aperçu de deux aspects clés de la fonction des gènes. Tout d'abord, en examinant les cellules transplantées à partir d'un embryon de donneur, dans laquelle un gène particulier a été renversé alors qu'ils se développent dans un environnement non marqué de type sauvage, nous permet d'obtenir des informations pertinentes sur la fonction des gènes d'une manière cellulaire autonome. Cela conduit à des informations importantes sur la fonction de la rétine facteurs sort déterminants au sein des cellules progénitrices ils sont normalement exprimés. Ceci est illustré par l'examen du sort des résultats de développement des progéniteurs qui ne peuvent plus générer une protéine fonctionnelle de ces gènes ^{4, 6, 8, 9.} En utilisant cette approche, nous avons montré que les facteurs déterminants du devenir beaucoup (par exemple, Vsx1, Atoh7, Ptf1a, Barhl2) agissent cellule-autonomously à conduire destins neuronales rétiniennes spécifiques; l'absence d'expression du gène conduit principalement à un commutateur sort, de telle sorte que les cellules avec le gène knockdown restent viables en adoptant un sort de remplacement cellulaire ^{4, 6, 7, 10.} Deuxièmement, ces expériences chimériques peuvent être utilisés pour évaluer la façon dont sauvage progéniteurs de type se comportent quand ils se développent dans différents environnements génétiques. Par exemple, en comparant le développement des cellules WT qui expriment habituellement un gène d'intérêt (et journaliste transgène) dans un WT contre environnement hôte manipulé (par exemple, KO génique / knockdown), les effets induits sur l' expression génique et le destin des cellules peuvent être évaluées . L'absence de certains types de neurones dans l'environnement hôte, par exemple, a été montré, pour influencer le comportement progénitrices de type sauvage d'une manière non-autonome cellulaire, pour solliciter eux vers la différenciation dans l'o sous-représentéesr manquant types de neurones ^{4, 7, 11, 12.} Étant donné que les neurones de la rétine sont nés dans un ordre histogène conservé par l'expression séquentiellement chronométré de gènes spécifiques sort déterminants neuronales (expression du gène sort) (revue dans ^13), nous avons utilisé ces méthodes pour démontrer comment le moment de l' expression du gène sort dans les progéniteurs de type sauvage est affectée lorsque ces progéniteurs se développent dans des environnements d'accueil rétiniens avec des compositions cellulaires aberrantes induites. Ici, nous présentons ces approches comme preuve de la façon dont la combinaison des techniques relativement standard et largement utilisé permet l'examen du moment de l' expression du gène sort dans le développement de progéniteurs rétiniens ^{8, 9.}

Ce protocole décrit une approche expérimentale combinant imagerie time-lapse avec la facilité de parformant la transplantation dans l'ex vivo développement embryon de poisson zèbre à suivre mosaically individuelle des cellules marquées pendant toute la période de rétinogenèse développement. En effectuant des manipulations génétiques fonctionnels, soit dans l'embryon hôte, donneur de l'embryon, les deux ou aucun, on peut évaluer l'autonomie de la cellule de la fonction des gènes. Cette approche peut être adaptée largement aux questions de recherche similaires dans tout autre système pour lequel les composants individuels décrits ici sont appropriés.

Protocol

Toutes les procédures ont été effectuées conformément aux dispositions du code Australian Medical Research Council Santé nationale et de la pratique pour les soins et l'utilisation des animaux et ont été approuvés par les comités d'éthique institutionnels. 1. Préparation de Zebrafish Adulte appariement des poissons Mettre en place les poissons adultes sous forme de paires (ou deux paires) en bassins d'élevage de taille appropriée le soir avant de…

Representative Results

Ce travail présente un protocole expérimental pour évaluer les changements dans le gène timing d'expression lorsque type sauvage progéniteurs rétiniens se développent dans un embryon morphant hôte. Les embryons hôtes expérimentaux sont morphants Ptf1a, qui manquent de interneurones intermédiaires nés horizontales et amacrines de la rétine 7, 26. Celles-ci ont été comparées pour contrôler les embryons hôtes, …

Discussion

Comprendre la mesure dans laquelle les cellules voisines influencent le moment de l'expression des facteurs déterminant du destin cellulaire essentiel est essentiel lorsque l'objectif est d'instruire efficacement les cellules souches multipotentes embryonnaires ou induites à se différencier en un type de cellule post-mitotique spécifique ou même des tissus à motifs. En outre, l' examen de ces événements moléculaires dans les cellules en développement de l'animal vivant fournit en outre dyna…

Materials

Agarose	Bioline	BIO-41025	Agarose coated dishes can be prepared a few days prior, sealed with parafilm to prevent drying and stored at 4C
Agarose low melt	Sigma	A9414-100G	Can be prepared in larger volume, microwaved to liquify and then kept molte in 40C waterbath. 1 ml aliquots can be prepared (one for each group of embryos mounted).
borosillicate glass capillary tube w/o filament	SDR Scientfic	30-0035	alternatives with similar diameter can be used
borosillicate glass capillary tube with filament	SDR Scientfic	30-0038	alternatives with similar diameter can be used
glass petri dishes (60 mm diameter)	Science Supply	1070506	any glass alternative of any size
Injection tube (2m)	Eppendorf	524616004	This connects the needle holder to the syringe during transplantation
Microinjection mold (plastic mold with wedge-shaped protrusions)	Adaptive Science Tools	PT-1	alternatives with similar shape can be use
microneedle holder	Narishige	M-152	any alternative that fits the outside diameter of the injection needles can be used
microinjector	Narishige or Eppendorf Femtojet		Pneumatic injector using gas pressure
micromanipulator	Coherent Scientific	M330IR	similar alternatives can be used
microloader tip	Eppendorf	5242956003
Mineral oil	Sigma	M5904-500ML
needle puller	Sutter Instruments	Model P-2000	Settings used for this puller are: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Any needle puller can be used if it results in appropriate tip dimension
Parafilm	Interpath	PM996	any paraffin film
Pasteur pipette plastic	Samco Scientific	202
Pasteur pipette glass	Hirschmann Laborgeraete	9260101
Pronase	Sigma	P5942-25MG	Protease Type XIV
N-phenyl thiourea	Sigma	P7629-25G	PTU is toxic and can be prepared as a stock solution to avoid frequent exposure to the powder, consult MSDS before purchase / use.
Qiaquick gel extraction	Qiagen	28704	any alternatives to purify DNA can be used
Rneasy Mini kit	Qiagen	74104	any alternatives to purify RNA can be used
SP6 mMessage kit	Qiagen	AM1340	any alternatives to transcribe DNA using SP6