In - vivo - Bildgebung von Expression Transgene Gene in einzelnen Retinal Vorläufern in Chimäre Zebrabärblingembryonen Studie Zellnichtautonome Einflüsse

Summary

Live Verfolgung einzelner WT retinalen Progenitoren in verschiedenen genetischen Hintergründen ermöglicht die Bewertung des Beitrags der Zelle nicht autonomen Signalisierung während der Neurogenese. Hier wird eine Kombination von Knock-Down, Chimäre Generation über Embryo – Transplantation und in – vivo – Zeitraffer-konfokale Abbildung wurde für diesen Zweck verwendet.

Abstract

Die genetischen und technischen Stärken haben die Zebrabärbling wirbel ein wichtiger Modellorganismus , in dem die Folgen von Gen – Manipulationen vorgenommen können während des schnellen Entwicklungszeit in vivo verfolgt werden. Mehrere Prozesse können einschließlich der Zellproliferation, der Genexpression, Zellmigration und Morphogenese untersucht werden. Wichtig ist, kann die Erzeugung von Chimären durch Transplantationen leicht durchgeführt werden, mosaic Kennzeichnung und Verfolgung einzelner Zellen unter dem Einfluß der Host-Umgebung ermöglicht. Zum Beispiel durch funktionelle Genmanipulationen des Wirtsembryo Kombination (zB durch Morpholino Mikroinjektions) und die Live – Darstellung, die Auswirkungen von extrinsischen, Zelle nichtautonomen Signale (von der gentechnisch veränderten Umgebung zur Verfügung gestellt) auf einzelnen transplantierten Spenderzellen beurteilt werden. Hier zeigen wir, wie dieser Ansatz verwendet wird, das Auftreten von fluoreszierenden Transgen-Expression als Proxy für den Zeitpunkt des Zellschicksals determin zu vergleichenation in verschiedenen genetischen Host-Umgebungen.

In diesem Artikel stellen wir das Protokoll für Mikroinjizierung Genaktivität Spenderzellen zu markieren und Knock-Down in Wirts Embryonen zu verursachen, eine Beschreibung des Transplantationstechnik verwendeten chimären Embryonen zu erzeugen, und das Protokoll für die Vorbereitung und in – vivo – Zeitraffer-konfokale läuft Bildgebungs mehrerer Embryonen. Insbesondere Multipositions-Bildverarbeitung ist entscheidend, wenn Timing von Ereignissen wie dem Ausbruch der Genexpression zu vergleichen. Dies erfordert die Datenerfassung von mehreren Kontroll- und Versuchs Embryonen gleichzeitig verarbeitet. Ein solcher Ansatz leicht für Studien der extrinsische Einflüsse in jedem Organ oder Gewebe der Wahl erweitert werden kann, zugänglich Bildgebung zu leben, vorausgesetzt, dass Transplantationen leicht nach etablierten embryonalen Schicksal Karten ausgerichtet werden können.

Introduction

Die Fähigkeit , wichtige Entwicklungsprozesse in einem in – vivo wirbel sichtbar zu machen , um die Herstellung der Zebrabärbling einen Schlüssel Modell für die Untersuchung normalen und Krankheitszuständen ( beschrieben in ^{1, 2)} beigetragen hat. Insbesondere ist die neurale Netzhaut eine zugängliche Teil des zentralen Nervensystems. Die Netzhaut eignet sich für leicht Studien der Neurogenese führen aufgrund ihrer hoch organisierten, aber relativ einfache Struktur, und seine hochkonservierten Neuron – Typen über Vertebratenarten ^3. Dynamik der zellulären Verhaltensweisen wie Proliferation, Zellzyklus Ausgang, asymmetrische Zellteilung, Schicksal Spezifikation, Differenzierung und neuronalen Schaltkreise Bildung kann über den gesamten Prozess von Retinogenese folgen, die in der zentralen Netzhaut des Zebrabärbling von 3 d postfertilization abgeschlossen ist ( dpf) ^{4, 5,}ref "> ^{6, 7.}

Darüber hinaus können die funktionalen Anforderungen verschiedener Gene in jeder der oben genannten Stufen gleichzeitig in der Zebrabärbling Retina beurteilt werden, einen Vorteil gegenüber anderen Wirbel Modelle, in denen die Bereitstellung Phänotypen aus der Anwendung der Gen-Knockout-Techniken, kann sie nur auf Obduktion bewertet werden von Geweben fixiert. Insbesondere die Verwendung von transgenen Linien in dem wir die Expression von fluoreszierenden Proteinen als Reporter Transgenen in der Netzhaut zu visualisieren und zu überwachen, ermöglicht es uns, die zeitliche Auflösung der Genexpression zu erhalten, die die Entstehung eines bestimmten neuronalen Zelltyp zu Grunde liegt. Aufgrund der schnellen Entwicklung von Zebrabärbling können diese Ereignisse während der gesamten Entwicklungszeit visualisiert werden, wodurch tiefere Einblicke in die zeitliche Bedeutung der Genexpression Verhalten in Bezug auf neuronale Zellidentitätserfassung und Zellenbereitstellt.

Schließlich können diese Ansätze wirksam mit der Erzeugung von Chimären über Transplantationen in der Zebrabärbling kombiniert werden, was zu Einsichten in zwei wesentliche Aspekte der Genfunktion. Erstens Zellen transplantiert von einem Spender Embryo untersuchen, in denen ein bestimmtes Gen wurde umgeworfen, während sie in einem unbeschrifteten Wildtyp-Umgebung zu entwickeln, ermöglicht es uns, relevante Informationen über die Genfunktion in einem zellautonome Weise zu erhalten. Dies führt zu wichtigen Erkenntnissen über die Funktion der retinalen Schicksal bestimmenden Faktoren in den Vorläuferzellen sie in der Regel ausgedrückt in. Dies wird durch die Prüfung des Entwicklungsschicksal Ergebnis von Vorläufern exemplifiziert , die nicht mehr funktionsfähiges Protein aus diesen Genen erzeugen können ^{4, 6, 8, 9.} Unter Verwendung dieses Ansatzes haben wir gezeigt , dass viele Schicksal bestimmenden Faktoren (zB Vsx1, Atoh7, PTF1A, Barhl2) handeln Zelle-autonomously spezifische Retina-Nerven Schicksale zu treiben; der Mangel der Genexpression führt in erster Linie zu einem Schicksal Schalter, so dass die Zellen mit Gen lebensfähig bleiben , durch Knockdown eine alternative Zellschicksal ^{4, 6, 7, 10} übernehmen. Zweitens kann eine solche Chimären-Experimente verwendet werden, um zu beurteilen, wie Wildtyp-Vorläufern verhalten, wenn sie in verschiedenen genetischen Umgebungen zu entwickeln. Zum Beispiel durch die Entwicklung von WT – Zellen zu vergleichen , die in der Regel ein Gen von Interesse (und Reporter – Transgen) in einem WT gegen manipulierte Host – Umgebung (zB Gen – Knockout / Knockdown), die daraus resultierenden Auswirkungen auf die Genexpression und Zellschicksal zum Ausdruck bringen kann beurteilt werden . Der Mangel an bestimmten Neuronentypen in der Host-Umgebung, zum Beispiel, sie Wildtyp-Vorläuferverhalten nicht autonom in einer Zelle Art und Weise ist, um Bias gezeigt zu beeinflussen Richtung in das unterrepräsentierte o Differenzierungsr fehlt neuron Typen ^{4, 7, 11, 12.} Da die Netzhautneuronen in einer konservierten histogenic Reihenfolge durch die sequentiell zeitlich Expression spezifischer neuronaler Schicksal Determinante Gene (Schicksal Genexpression) ( beschrieben in ¹³⁾ geboren, haben wir diese Methoden zu zeigen , wie der Zeitpunkt des Ausdrucks Schicksal Gen in Wildtyp – Vorläufern betroffen ist, wenn eine solche Vorläufern in Retina-Host-Umgebungen mit induzierten anomale Zellzusammensetzungen zu entwickeln. Hier erläutern wir diese Ansätze als Beweis dafür , wie die Kombination aus relativ Standard und weit verbreitete Techniken , um die Prüfung des Timing des Schicksals Genexpression ermöglicht retinalen Vorläufern ⁸ in der ^{Entwicklung, 9.}

Dieses Protokoll beschreibt einen experimentellen Ansatz, Zeitraffer-Bildgebung mit der Leichtigkeit proBildung Transplantation in der ex vivo Entwicklung Zebrafischembryo einzelne mosaik markierten Zellen während der gesamten Dauer der Entwicklungs Retinogenese zu folgen. Durch das Durchführen funktioneller Genmanipulationen entweder im Wirtsembryo, Spenderembryo, beide oder keines von beiden, kann man die Zelle Autonomie der Genfunktion bewerten. Dieser Ansatz kann in jedem anderen System weitgehend auf ähnliche Forschungsfragen angepasst werden, für die die einzelnen Komponenten hier skizzierten geeignet sind.

Protocol

Alle Verfahren wurden nach der Australian National Health und Medical Research Council Verhaltenskodex der Bestimmungen durchgeführt für die Pflege und Verwendung von Tieren und wurden von den institutionellen Ethikkommissionen genehmigt. 1. Herstellung von Zebrabärbling Erwachsene Fische Paarung Richten Sie wachsene Fische als Paare (oder zwei Paare) in geeigneter Größe Zuchtbecken am Abend vor der Verwendung. Um die Weibchen vom Männchen getrennt zu halt…

Representative Results

Diese Arbeit stellt eine experimentelle Protokoll Veränderungen in der Genexpression Timing zu beurteilen, wenn Wildtyp-Retina-Vorläufern in einem morphant Wirtsembryo entwickeln. Die experimentellen Host Embryonen sind PTF1A morphants, die die Zwischen geboren horizontal und amacrine lnterneurone der Retina 7, 26 fehlen. Diese wurden verglichen Wirtsembryos zu steuern, die mit einer Standard-Steuer morpholino injiziert. <p…

Discussion

das Ausmaß, in dem Verständnis benachbarten Zellen Timing der Expression von entscheidender Zellschicksal bestimmenden Faktoren beeinflussen ist wichtig, wenn embryonale oder induziert multipotenter Stammzellen in eine bestimmte post-mitotischen Zelltyp oder sogar gemusterten Gewebe zu unterscheiden, um effizient anweisen Ziel. Darüber hinaus in den Entwicklungs Zellen des lebenden Tieres , diese molekularen Vorgänge der Prüfung stellt zusätzlich relevante dynamische (zeitliche und räumliche) Informationen über …

Materials

Agarose	Bioline	BIO-41025	Agarose coated dishes can be prepared a few days prior, sealed with parafilm to prevent drying and stored at 4C
Agarose low melt	Sigma	A9414-100G	Can be prepared in larger volume, microwaved to liquify and then kept molte in 40C waterbath. 1 ml aliquots can be prepared (one for each group of embryos mounted).
borosillicate glass capillary tube w/o filament	SDR Scientfic	30-0035	alternatives with similar diameter can be used
borosillicate glass capillary tube with filament	SDR Scientfic	30-0038	alternatives with similar diameter can be used
glass petri dishes (60 mm diameter)	Science Supply	1070506	any glass alternative of any size
Injection tube (2m)	Eppendorf	524616004	This connects the needle holder to the syringe during transplantation
Microinjection mold (plastic mold with wedge-shaped protrusions)	Adaptive Science Tools	PT-1	alternatives with similar shape can be use
microneedle holder	Narishige	M-152	any alternative that fits the outside diameter of the injection needles can be used
microinjector	Narishige or Eppendorf Femtojet		Pneumatic injector using gas pressure
micromanipulator	Coherent Scientific	M330IR	similar alternatives can be used
microloader tip	Eppendorf	5242956003
Mineral oil	Sigma	M5904-500ML
needle puller	Sutter Instruments	Model P-2000	Settings used for this puller are: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Any needle puller can be used if it results in appropriate tip dimension
Parafilm	Interpath	PM996	any paraffin film
Pasteur pipette plastic	Samco Scientific	202
Pasteur pipette glass	Hirschmann Laborgeraete	9260101
Pronase	Sigma	P5942-25MG	Protease Type XIV
N-phenyl thiourea	Sigma	P7629-25G	PTU is toxic and can be prepared as a stock solution to avoid frequent exposure to the powder, consult MSDS before purchase / use.
Qiaquick gel extraction	Qiagen	28704	any alternatives to purify DNA can be used
Rneasy Mini kit	Qiagen	74104	any alternatives to purify RNA can be used
SP6 mMessage kit	Qiagen	AM1340	any alternatives to transcribe DNA using SP6