التصوير تلألؤ بيولوجي من Neuroinflammation في الفئران المعدلة وراثيا بعد الطرفية تلقيح ألفا Synuclein الألياف
Summary
حقن الطرفية من الألياف، synuclein ألفا في الصفاق أو اللسان من تيراغرام (M83 +/-: GFAP -luc +/-) الفئران، التي تعبر عن الإنسان ألفا synuclein مع الطفرة A53T العائلية واليراع وسيفيراز، يمكن أن تحفز الأعصاب، بما في ذلك neuroinflammation في الجهاز العصبي المركزي الخاصة بهم.
Abstract
لدراسة سلوك مثل بريون من تتجمع ألفا synuclein، هناك حاجة إلى نماذج الماوس التي تسمح انتقال سريع وبسيط من prionoids ألفا synuclein، والتي تتسبب في أمراض الأعصاب في الجهاز العصبي المركزي (CNS). نحن هنا وصف تلك intraglossal أو الحقن داخل الصفاق من الألياف، synuclein ألفا إلى bigenic تيراغرام (M83 +/-: GFAP -luc +/-) الفئران التي بإفراط البشري ألفا synuclein مع الطفرة A53T من المروج بروتين بريون ويراعة luciferase من المروج لييفي الدبقية البروتين الحمضية (GFAP)، ويكفي للحث على المرض neuropathologic. بالمقارنة مع تيراغرام متماثل (M83 + / +) الفئران التي تتطور لديهم أعراض عصبية شديدة بدءا من سن 8 أشهر، متخالف تيراغرام (M83 +/-: GFAP -luc +/-) الحيوانات تبقى خالية من المرض من تلقاء أنفسهم حتى التوصل إلى سن 22 شهرا. ومن المثير للاهتمام، حقن الألياف-synuclein ألفا عبر intraperitoneآل الطريق التي يسببها مرض عصبي مع الشلل في أربعة من خمسة تيراغرام (M83 +/-: GFAP -luc +/-) الفئران مع فترة حضانة متوسط 229 ± 17 يوما. أظهرت الحيوانات المريضة ودائع شديدة من فسفرته ألفا synuclein في أدمغتهم والنخاع الشوكي. كانت تراكمات ألفا synuclein sarkosyl-غير قابلة للذوبان وcolocalized مع اليوبيكويتين وP62، وكان يرافقه استجابة التهابية مما أدى إلى دباق نجمي الخلايا وكثرة الدبيقيات. والمثير للدهشة، كان التلقيح من الألياف، synuclein ألفا في اللسان أقل فعالية في التسبب في مرض واحد فقط من خمسة الحيوانات المحقونة تظهر ألفا synuclein علم الأمراض بعد 285 يوما. وتشير النتائج التي توصلنا إليها أن التلقيح عبر الطريق intraglossal وأكثر من ذلك عبر الطريق داخل الصفاق هو مناسبة للحث على مرض عصبي مع بصمات ذات الصلة synucleinopathies في تيراغرام (M83 +/-: GFAP -luc +/-) الفئران. وهذا يوفر نموذجا جديدا لدراسة مثل بريون المرضية لحثد كتبها prionoids ألفا synuclein بمزيد من التفصيل.
Introduction
وهناك أدلة متزايدة على أن ألفا synuclein له خصائص مشابهة لتلك التي بروتين بريون، لا سيما في قدرتها على البذور الذاتي ونشر misfolding بين الخلايا وعلى طول الممرات العصبية. ويشار إلى هذه الخاصية ألفا synuclein أيضا باسم "بريون مثل 'أو' prionoid"، وبدعم من الملاحظات في تجارب زراعة الأعضاء، والتي توحي على الانتقال من تتجمع ألفا synuclein من الخلايا العصبية المريضة لزرع حديثا الخلايا العصبية السليمة 1، 2 و 3 و 4. أيضا الحقن المباشر للتتجمع ألفا synuclein في الدماغ أو المحيط، مثل العضلات hindlimb أو جدار الأمعاء، والنتائج في انتشار أمراض ألفا synuclein إلى أجزاء البعيدة للCNS 5، 6، 7، <سوب الطبقة = "XREF"> 8 و 9 و 10. قمنا بتحليل انتقال prionoids ألفا synuclein عبر طرق الطرفية في مزيد من التفاصيل وتناول مسألة ما إذا كانت تتجمع ألفا synuclein قد neuroinvade الجهاز العصبي المركزي بعد intraglossal احد أو الحقن داخل الصفاق، وهي الميزة التي سبق قد تعرض لالبريونات ولكن ليس لألفا تتجمع synuclein. بعد حقن البريونات في اللسان، ويتحقق neuroinvasion من الجهاز العصبي المركزي عن طريق نشر على طول العصب تحت اللسان لسان الذي يؤدي إلى نواة العصب تحت اللسان، والذي يقع في جذع الدماغ (11). كنموذج الماوس اخترنا تيراغرام (M83 +/-: GFAP -luc +/-) الفئران التي بإفراط متحولة A53T من البشر ألفا synuclein من المروج بريون، ويراعة luciferase تحت سيطرة أحد المروجين GFAP لمراقبة تفعيل نجمي الخلايا التي تلألؤ بيولوجي، كما هو موضح سابقا في دماغبريون-إصابة الفئران 12. في أيدينا bigenic تيراغرام (M83 +/-: GFAP -luc +/-) الفئران لم تتطور المرض حتى 23 شهرا من العمر كما لم تظهر من قبل الآخرين (13). حقنة واحدة من الألياف، synuclein ألفا الإنسان عبر intraglossal أو داخل الصفاق الطريق التي يسببها المرض العصبي يعانون من أمراض في العقول والنخاع الشوكي من تيراغرام (M83 +/-: GFAP -luc +/-) الفئران دعم الفرضية القائلة بأن prionoids ألفا synuclein مشاركة الخصائص المهمة مع البريونات 14.
Protocol
Representative Results
Discussion
حقن الطرفية من الألياف، synuclein ألفا في الصفاق من تيراغرام (M83 +/-: GFAP -luc +/-) يمثل الفئران طريقة سطحي للحث على مرض عصبي يرافقه neuroinflammation لتلخيص الخصائص المهمة للsynucleinopathies. وبالمثل، يمثل حقن اللسان طريقا آخر للneuroinvasion التي كتبها prionoids ألفا synuclein في الفئران ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أشكر أولغا شارما، تيريزا هوندت، وموظفي الفحص المجهري والحيوان مرافق DZNE حصول على الدعم الفني.
Materials
| anti-actin antibody | Merck Millipore | MAB1501 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [pSyn#64] | Wako | 015-25191 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [EP1536Y] | Abcam | ab51253 | |
| anti-GFAP antibody | Dako | Z0334 01 | |
| anti-IBA-1 antibody | Wako | 019-19741 | |
| anti-Sequestosome-1 (p62) antibody | Proteintech | 18420-1-AP | |
| anti-ubiquitin antibody [Ubi-1] | Merck Millipore | MAB1510 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Invitrogen | 14190169 | |
| Ketamine | Ratiopharm | 100 mg/kg | |
| Xylazine | Ratiopharm | 10 mg/kg | |
| 27-gauge syringe | VWR | 613-4900 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | PZN 4831850 | |
| Depilatory cream | Veet | ||
| Secureline lab marker | Neolab | 25040 | |
| D-luciferin potassium salt | Acris | LK10000 | 30 mg/mL stock solution |
| Thermomixer | Eppendorf | 5776671 | |
| Sonopuls Mini20 sonicator | Bandelin | 3648 | |
| IVIS Lumina II imaging system | PerkinElmer | ||
| Living Image 3.0 Software | PerkinElmer | ||
| Tg(M83+/-) mice or B6;C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J mice | The Jackson Laboratory | 004479 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| N-laurylasarcosyl | Sigma | L5125-100G | |
| Optima Max-XP ultracentrifuge | Beckman Coulter | TLA-110 rotor | |
| Thickwall polycarbonate tubes | Beckman Coulter | 362305 | |
| NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | WG1401BOX | |
| HRP conjugated antibody | Cayman | Cay10004301-1 | |
| IR Dye 680 conjugated antibody | LI-COR Biosciences | 926-68070 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34075 | |
| Stella 3200 imaging system | Raytest | ||
| Odyssey infrared imaging system | LI-COR Biosciences | ||
| Tween 20 | MP Biomedicals | TWEEN201 | |
| Triton X-100 | Sigma | SA/T8787 | |
| Immobilon-FL PVDF membrane | Merck Millipore | IPFL00010 | |
| Xylol | Sigma | Roth | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | SA/00216763/000500 | working solution 3% |
| Bovine serum albumine (BSA) | Thermo Fisher Scientific | A3294-100G | |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | working dilution 1:50,000 |
| Fluoromount media | Omnilab | SA/F4680/000025 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | ||
| HALT protease and phosphatase inhibitors | Thermo Fisher Scientific | 10516495 | |
| Precellys 24-Dual homogenizer | Peqlab | 91-PCS24D | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A31619 | |
| Alexa Fluor 594 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A11005 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 10741395 | |
| Microtome RM2255 | Leica | ||
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss |
References
- Aguzzi, A. Cell biology: Beyond the prion principle. Nature. 459 (7249), 924-925 (2009).
- Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Freeman, T. B., Olanow, C. W. Lewy body-like pathology in long-term embryonic nigral transplants in Parkinson’s disease. Nat Med. 14 (5), 504-506 (2008).
- Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson’s disease suggest host-to-graft disease propagation. Nat Med. 14 (5), 501-503 (2008).
- Hansen, C., et al. alpha-Synuclein propagates from mouse brain to grafted dopaminergic neurons and seeds aggregation in cultured human cells. J Clin Invest. 121 (2), 715-725 (2011).
- Masuda-Suzukake, M., et al. Prion-like spreading of pathological alpha-synuclein in brain. Brain. 136 (4), 1128-1138 (2013).
- Holmqvist, S., et al. Direct evidence of Parkinson pathology spread from the gastrointestinal tract to the brain in rats. Acta Neuropathol. 128 (6), 805-820 (2014).
- Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
- Sacino, A. N., et al. Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 1, 38 (2013).
- Sacino, A. N., et al. Intramuscular injection of alpha-synuclein induces CNS alpha-synuclein pathology and a rapid-onset motor phenotype in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10732-10737 (2014).
- Mougenot, A. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol Aging. 33 (9), 2225-2228 (2012).
- Bartz, J. C., Kincaid, A. E., Bessen, R. A. Rapid prion neuroinvasion following tongue infection. J Virol. 77 (1), 583-591 (2003).
- Tamgüney, G., et al. Measuring prions by bioluminescence imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 15002-15006 (2009).
- Watts, J. C., et al. Transmission of multiple system atrophy prions to transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (48), 19555-19560 (2013).
- Breid, S., et al. Neuroinvasion of alpha-Synuclein Prionoids after Intraperitoneal and Intraglossal Inoculation. J Virol. 90 (20), 9182-9193 (2016).
- Giasson, B. I., et al. Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein. Neuron. 34 (4), 521-533 (2002).
- Zhu, L., et al. Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice. Neurosci Lett. 367 (2), 210-212 (2004).
- Bernis, M. E., et al. Prion-like propagation of human brain-derived alpha-synuclein in transgenic mice expressing human wild-type alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 3 (1), 75 (2015).
- Gunther, R., et al. Clinical testing and spinal cord removal in a mouse model for amyotrophic lateral sclerosis (ALS). J Vis Exp. (61), (2012).
- Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson’s disease. Nat Protoc. 2 (1), 141-151 (2007).
- Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol Biol. 536, 499-513 (2009).
- Kim, C., et al. Exposure to bacterial endotoxin generates a distinct strain of alpha-synuclein fibril. Sci Rep. 6, 30891 (2016).
- Keller, A. F., Gravel, M., Kriz, J. Live imaging of amyotrophic lateral sclerosis pathogenesis: disease onset is characterized by marked induction of GFAP in Schwann cells. Glia. 57 (10), 1130-1142 (2009).
- Stöhr, J., et al. Distinct synthetic Abeta prion strains producing different amyloid deposits in bigenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).
- Luk, K. C., et al. Intracerebral inoculation of pathological alpha-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative alpha-synucleinopathy in mice. J Exp Med. 209 (5), 975-986 (2012).
- Recasens, A., et al. Lewy body extracts from Parkinson disease brains trigger alpha-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys. Ann Neurol. 75 (3), 351-362 (2014).
- Sacino, A. N., et al. Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 1 (1), 38 (2013).
- Peelaerts, W., et al. alpha-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration. Nature. 522 (7556), 340-344 (2015).
