Desenlendirme Proteinlerin ve Hücreleri Çok Yönlü Yöntemi
Summary
This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.
Abstract
Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.
Introduction
Doku mühendisliği ve biosensörleme, bir mikron ölçeğinde proteinleri ve hücreleri mekansal organizasyonu kontrol etme yeteneği, son dört yılda 1, 2, 3 üzerinde giderek daha önemli hale gelmiştir. Protein ve hücrelerin hassas mekansal organizasyon, araştırmacılar, hücre büyümesini yol ve biyosensörler 4, 5, 6, 7, 8, üretim için biyomoleküllerin hareketsiz hale getirmek için, hücrelerin benzer ya da farklı türlerini içeren hücreler ve alt tabakalar arasındaki etkileşimi incelemek sağladı 9.
desen proteinlerinin Mevcut yöntemler photopatterning ve microcontact baskı bulunmaktadır. Photopatterning ultr maruz kalması üzerine çapraz bağlanır ışığa duyarlı malzeme kullanılanmor (UV) ışık. (UV ışığı iletim önlemek için daha koyu bölgeler saydam alanlarında oluşan) bir fotomaske yönelik UV ışığı daha sonra biyo veya hücre 10, 11 daha sonra eklenmesi için kullanılabilen belirli bölgelerde çapraz bağlama neden olur. Bu düzeni çok doğru ve kültür yüzey topografyasının hassas kontrol sağlar, UV radyasyonu 12 ile desenli olabilir UV duyarlı biyomoleküllerin sınırlıdır. Microcontact baskı özel proteinler 13, 14 desenlendirme başka popüler bir yöntemdir. Bu yöntemde, bir poli-dimetil siloksan (PDMS) Pul seçilen biyomoleküler alt-tabakanın bir çözelti içinde ıslatılan önce yüzey değiştirme reaktifler çeşitli ile işlenir. Daha sonra yavaşça ve böylece, kültür yüzey üzerine biyomolekülün "damgalama" cam lamel veya diğer yüzeyi üzerine bastırılmaktadır. HoWever, damgalama PDMS 15 damga yüzeyine biyomoleküllerin ıslanabilirliği hem de aktarılabilir malzemenin türüne sınırlıdır.
Hücrelerin doğrudan desen daha zor olabilir ve bu özel hücre yapışma molekülleri 16, 17 ile değiştirilebilir alt tabakalar, Şablon göre yöntem ya da desen gibi karmaşık yöntemle gerçekleştirilir olabilir. Bu yöntemler sayesinde uyumlu hücre yapışma yüzeylerde eksikliği desen hücrelerine yetenekleri sınırlıdır, sürecin uyumsuzluk duyarlı biyolojik hücreler ve kısıtlamaları, desenlendirme üreyen tutarsızlık ve prosedürün karmaşıklığı ile çalışmak. Örneğin, değiştirilebilir yüzeyler ile özel yüzeyler <sürecinde 17 kullanılan UV ışınlarına ve ısıya maruz kalma üzerine bozulma olmadan belirli hücre tiplerine bağlılıklarını geçmek için, her hücre tipi için tasarlanmış olması gerekir sup class = "xref"> 18, 19, 20. Stencil tabanlı desenlendirme yöntemleri desen hücrelerine yeteneklerini çok yönlü; Bununla birlikte, kullanım 16, 21 için uygun kalınlıklarda PDMS kalıpları üretmek zordur. 1) mikroakışkan kanalların üretiminde kolaylığı ve birçok farklı hücre ve yüzeyler için 2) uygunluk: PDMS mikroakışkan kanal içine hücrelerin direkt enjeksiyon bazı avantajlar gibi var. Ancak, hava kabarcıklarını azaltmak için plazma temizleme ya da diğer yöntemleri kullanmadan PDMS hidrofobiklik enjeksiyon işlemi sırasında hava kabarcığı yakalama yaygın sorun, zor sürekli cam veya plastik yüzeylerde 21 desenli hücreleri oluşturmayı kolaylaştırır.
Bu eser, kılcal micromolding 22, 23 genişliyorlass = "xref"> 24, 25, 26 ve mikro halinde protein ve hücre süspansiyonları enjekte etmek için bir metodu bildirir. Burada kullanılan yöntem yüzeylerde desenlendirme ve spesifik hücre tiplerinin her ikisi de doğrudan ve dolaylı desenlendirme göstermektedir. Bu teknik, PDMS yüksek hidrofobikliğini üstesinden gelir ve PDMS 27 gaz geçirgenliği yararlanarak iki alt tabakaların veya hücre enjeksiyonu sırasında kabarcıkların mevcudiyetini ortadan kaldırır. Bu çalışma, birçok farklı alt-tabaka ve hücre tipleri ile tekniğin kullanımını gösterir. Makalede ayrıca, geleneksel fotolitografi yanı sıra kaynak kullanışlı, basit ve düşük maliyetli yapışkan bant yöntemi sınırlı ayarlar 28, 29 kullanılarak yumuşak litografi için kalıp imalat vurgulamaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Geleneksel fotolitografi yumuşak litografi, ekipman, malzeme ve geleneksel fotolitografi kullanmak için gerekli becerileri için kalıplar oluşturulması için köklü bir tekniktir iken en laboratuarlara hazır değildir. Bu kaynaklara erişimi olmayan laboratuarlar için, mikroakışkan cihazlar için nispeten basit özelliklere sahip kalıplar oluşturma yöntemi olarak yapışkan bant imalat sunduk. Bu yöntem, herhangi bir laboratuvar oluşturmak ve hazır araçları ile araştırma amacıyla mikroakışkan ciha…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma için finansman (FHK için) Omurilik Araştırma (NJCSCR) New Jersey Komisyonu tarafından sağlanan, (BLF için) CSCR14IRG005 hibe NIH (ÇHC için) R15NS087501 ve (ETA için) FM Kirby Vakfı hibe.
Materials
| CorelDRAW X4 CAD Drawing Tools | Corel Corporation, Canada | X4 Version 14.0.0.701 | CAD tool used to draw the layout of the microfluidic device |
| Laser Printer HP | Hewlett Packard, CA | 1739629 | Used to print the layout of microfluidic device for adhesive tape technique |
| Bel-Art Dessicator | Fisher Scientific, MA | 08-594-16B | Used to degass the PDMS mixture |
| Adhesive Scotch Tape | 3M Product, MN | Tape 600 | Used to fabricate adhesive tape Master |
| PDMS Sylgard 184 | Dow Corning, MI | 1064291 | Casting polymer |
| Petri Dish | Fisher Scientific, MA | 08-772-23 | Used to keep the mold to cast with PDMS |
| Stainless steel Scalpel (#3) with blade (# 11) | Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan | 2976#11 | Used to cut the PDMS |
| Tweezers | Ted Pella, CA | 5627-07 | Used to handle the PDMS cast during peeling |
| Glass slides | Fisher Scientific, MA | 12-546-2 | Used as surface to pattern the Substrate |
| Glass slides | Fisher Scientific, MA | 12-544-4 | Used as surface to pattern the Substrate |
| Rubber Roller | Dick Blick Art Materials, IL | 40104-1004 | Used to attach adhesive tape on glass without trapping air bubbles |
| Laser Mask Writer | Heidelberg Instruments, Germany | DWL66fs | Used to fabricate quartz mask used in photolithography fabrication process |
| EVG Mask Aligner (Photolithography UV exposure tool) | EV Group, Germany | EVG 620T(B) | Used to expose the photoresist to UV light |
| Spin Coater Headway | Headway Research Inc, TX | PWM32-PS-CB15PL | Used to spin coat the photoresist on silicon wafer |
| Photoresists SU-8 50 | MicroChem, MA | Y131269 | Negative photoresist used for mold fabrication |
| SU-8 Devloper | MicroChem, MA | Y020100 | Photoresist developer |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane | UCT Specialties, PA | T2492-KG | Coat mold to avoid PDMS adhesion |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich, MO | 190764 | Cleaning Solvent |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, MO | 24102 | Sterilization Solvent |
| Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich, MO | P0899-10MG | PDL solution is made at 0.1 mg/mL in Sodium Tetraborate Buffer |
| Laminin | Sigma-Aldrich, MO | L2020 | Laminin aliquoted into 10 µL aliquots and diluted to 20 µg/µL in PBS prior to use |
| BSA | Fisher Scientific, MA | BP1605100 | Cell culture |
| C2C12 Myoblast cell lline | ATCC, VA | CRL-1722 | Used to demonstrate C2C12 patterning |
| PC12 Cell Line | ATCC, VA | CRL-1721 | Used to demonstrate PC12 patterning |
| Collagen type 1, rat tail | BD Biosciences | 40236 | Cell culture |
| DMEM | GIBCO, MA | 11965-084 | Cell culture |
| Horse Serum, heat inactivated | Fisher Scientific, MA | 26050-070 | Cell culture |
| Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC) | Sigma-Aldrich, MO | P1951 | To label cells |
| Calcein-AM live dead cell Assay kit | Invitrogen, MA | L-3224 | Cell viability Assay |
| Biopsy Hole Punch | Ted Pella, CA | 15110-10 | Punched hole in PDMS |
References
- Kane, R. S., Takayama, S., Ostuni, E., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. Patterning proteins and cells using soft lithography. Biomaterials. 20 (23-24), 2363-2376 (1999).
- Lin, R. Z., Ho, C. T., Liu, C. H., Chang, H. Y. Dielectrophoresis based-cell patterning for tissue engineering. Biotechnol J. 1 (9), 949-957 (2006).
- Veiseh, M., Zareie, M. H., Zhang, M. Highly Selective Protein Patterning on Gold-Silicon Substrates for Biosensor Applications. Langmuir. 18 (17), 6671-6678 (2002).
- Kung, F., Wang, J., Perez-Castillejos, R., Townes-Anderson, E. Position along the nasal/temporal plane affects synaptic development by adult photoreceptors, revealed by micropatterning. Integr Biol. 7 (3), 313-323 (2015).
- Dickinson, L. E., Lutgebaucks, C., Lewis, D. M., Gerecht, S. Patterning microscale extracellular matrices to study endothelial and cancer cell interactions in vitro. Lab Chip. 12 (21), 4244-4248 (2012).
- Khademhosseini, A., et al. Co-culture of human embryonic stem cells with murine embryonic fibroblasts on microwell-patterned substrates. Biomaterials. 27 (36), 5968-5977 (2006).
- Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. Studying cell-cell communication in co-culture. Biotechnol J. 8 (4), 395-396 (2013).
- Choi, Y., Lee, S. Guided cell growth through surface treatments. J of Mech Sci Technol. 19 (11), 2133-2137 (2005).
- Hwang, I. -. T., et al. Efficient Immobilization and Patterning of Biomolecules on Poly(ethylene terephthalate) Films Functionalized by Ion Irradiation for Biosensor Applications. ACS Appl Mater Interf. 3 (7), 2235-2239 (2011).
- Clark, P., Britland, S., Connolly, P. Growth cone guidance and neuron morphology on micropatterned laminin surfaces. J Cell Sci. 105 (1), 203-212 (1993).
- Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J Cell Sci. 123 (24), 4201-4213 (2010).
- Douvas, A., et al. Biocompatible photolithographic process for the patterning of biomolecules. Biosens Bioelectron. 17 (4), 269-278 (2002).
- Alom, R. S., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
- Essö, C. Modifying Polydimethylsiloxane (PDMS) surfaces. Institutionen för biologi och kemiteknik. , (2007).
- Zhou, J., Ellis, A. V., Voelcker, N. H. Recent developments in PDMS surface modification for microfluidic devices. Electrophoresis. 31 (1), 2-16 (2010).
- Folch, A., Jo, B. H., Hurtado, O., Beebe, D. J., Toner, M. Microfabricated elastomeric stencils for micropatterning cell cultures. J Biomed Mater Res. 52 (2), 346-353 (2000).
- Yeo, W. S., Yousaf, M. N., Mrksich, M. Dynamic interfaces between cells and surfaces: electroactive substrates that sequentially release and attach cells. J Am Chem Soc. 125 (49), 14994-14995 (2003).
- Bhatia, S. N., Toner, M., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Selective adhesion of hepatocytes on patterned surfaces. Ann N Y Acad Sci. 745, 187-209 (1994).
- Song, E., Kim, S. Y., Chun, T., Byun, H. -. J., Lee, Y. M. Collagen scaffolds derived from a marine source and their biocompatibility. Biomaterials. 27 (15), 2951-2961 (2006).
- Yamato, M., Konno, C., Utsumi, M., Kikuchi, A., Okano, T. Thermally responsive polymer-grafted surfaces facilitate patterned cell seeding and co-culture. Biomaterials. 23 (2), 561-567 (2002).
- Takayama, S., et al. Patterning cells and their environments using multiple laminar fluid flows in capillary networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (10), 5545-5548 (1999).
- Kim, D. S., Lee, K. -. C., Kwon, T. H., Lee, S. S. Micro-channel filling flow considering surface tension effect. J of Micromech Microeng. 12 (3), 236 (2002).
- Kim, E., Xia, Y., Whitesides, G. M. Micromolding in Capillaries: Applications in Materials Science. J Am Chem Soc. 118 (24), 5722-5731 (1996).
- Kim, E., Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Polymer Microstructures Formed by Molding in Capillaries. Nature. 376 (6541), 581-584 (1995).
- Jeon, N. L., Choi, I. S., Xu, B., Whitesides, G. M. Large-area patterning by vacuum-assisted micromolding. Adv Mater. 11 (11), 946 (1999).
- Shrirao, A. B., et al. System and method for novel microfluidic device. US patent. , (2010).
- Merkel, T. C., Bondar, V. I., Nagai, K., Freeman, B. D., Pinnau, I. Gas sorption, diffusion, and permeation in poly(dimethylsiloxane). J Polym Sci Part B Polym Phys. 38 (3), 415-434 (2000).
- Shrirao, A. B., Hussain, A., Cho, C. H., Perez-Castillejos, R. Adhesive-tape soft lithography for patterning mammalian cells: application to wound-healing assays. Biotechniques. 53 (5), 315-318 (2012).
- Shrirao, A. B., Perez-Castillejos, R. Chips & tips: simple fabrication of microfluidic devices by replicating scotch-tape masters. Lab Chip. , (2010).
- Anil, B. S., Frank, H. K., Derek, Y., Cheul, H. C., Ellen, T. -. A. Vacuum-assisted fluid flow in microchannels to pattern substrates and cells. Biofabrication. 6 (3), 035016 (2014).
- Yuen, P. K., Goral, V. N. Low-cost rapid prototyping of flexible microfluidic devices using a desktop digital craft cutter. Lab on a Chip. 10 (3), 384-387 (2010).
- Wang, L., et al. Self-loading and cell culture in one layer microfluidic devices. Biomed Microdevices. 11 (3), 679-684 (2009).
- Feng, H., et al. Survival of mammalian cells under high vacuum condition for ion bombardment. Cryobiology. 49 (3), 241-249 (2004).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).
- Fan, D. -. H., Yuan, S. -. W., Shen, Y. -. M. Surface modification with BSA blocking based on in situ synthesized gold nanoparticles in poly (dimethylsiloxane) microchip. Colloids Surf, B. 75 (2), 608-611 (2010).
- Hideshima, S., Sato, R., Inoue, S., Kuroiwa, S., Osaka, T. Detection of tumor marker in blood serum using antibody-modified field effect transistor with optimized BSA blocking. Sens Actuator B-Chem. 161 (1), 146-150 (2012).
- Zheng, C., et al. High-throughput immunoassay through in-channel microfluidic patterning. Lab on a Chip. 12 (14), 2487-2490 (2012).
- MacLeish, P., Barnstable, C., Townes-Anderson, E. Use of a monoclonal antibody as a substrate for mature neurons in vitro. Procs Nat Acad of Sci. 80 (22), 7014-7018 (1983).
- Suchodolskis, A., et al. Elastic properties of chemically modified baker’s yeast cells studied by AFM. Surf Interface Anal. 43 (13), 1636-1640 (2011).
