In Vitro визуализации и количественному Таргетинг эффективности наркоконтроля флуоресцентно меченных ГнРГ Аналогов
Summary
Избирательно меченый флуоресцентной GnRH-I, -II и -III производные являются надежные инструменты для отслеживания и количественной оценки их клеточного поглощения. Эта рукопись представляет эксперименты для визуализации, количественной оценки и сравнения эффективности поглощения этих ГнРГ конъюгатов в различных клеточных линиях.
Abstract
аналоги ГнРГ являются эффективными и Целевые фрагменты способны доставить противораковые агенты избирательно в злокачественные опухоли клетки, которые высоко выражают рецепторы ГнРГ. Тем не менее, количественный анализ клеточного поглощения аналогов GnRH 'и исследуемые типы клеток в ГнРГ на основе систем доставки лекарственных средств в настоящее время ограничены. Ранее введены, селективно помечены флуоресцентной ГнРГ I, -II и -III производные обеспечивают высокую выявляемость, и у них есть подходящие химические свойства для воспроизводимых и надежных экспериментов. Мы также обнаружили, что соответствующие методы уточненный с этими мечеными аналогами ГнРГ может предложить новую информацию о ГнРГ на основе систем доставки лекарственных средств. Эта рукопись вводит некоторые простые и быстрые эксперименты относительно клеточному поглощению [D-Lys 6 (FITC)] – GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC)] – GnRH-II и [Lys 8 (FITC)] – ГнРГ -III на EBC-1 (легкие), то BxPC-3 (поджелудочная железа) и на Detroit-562- (зева) злокачественная тumor клетки. Параллельно с этим ГнРГ-FITC конъюгатов, уровень поверхности клеток рецепторов GnRH-I также исследовали на этих клеточных линиях до и после лечения ГнРГ с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Клеточное поглощение ГнРГ-FITC конъюгатов количественно оценивали с помощью флуоресцентной активированный сортировки клеток. В этих экспериментах наблюдалось незначительные различия между ГнРГ аналогов и основных различий между типами клеток. Значительные различия между клеточных линий коррелируют с их отчетливым уровнем рецепторов клеточной поверхности, GnRH-I. Введенные эксперименты содержат практические методы для визуализации, количественной оценки и сравнения эффективности поглощения ГнРГ-FITC конъюгатов в времени и зависимости от концентрации на различных культур прикрепленных клеток. Эти результаты могут предсказать наркотиков ориентации эффективность ГнРГ конъюгатов по данной культуре клеток, и предлагают хорошую основу для дальнейших экспериментов в изучении ГнРГ на основе систем доставки лекарственных средств.
Introduction
Целевые системы доставки лекарственных средств на основе пептидов стали быстро развивающееся и перспективное направление в терапии рака в течение последних нескольких лет 1, 2. Человеческий гонадотропин тип высвобождения гормона рецептор I (ГнРГ-IR) в основном находится в гипофизе , но также присутствует в ряде других тканей , которые ответственны за самовоспроизводства 3. ГнРГ-IR также выражается в ряде раковых тканей, связанные или не связанные с репродуктивной системой 4, 5. Высокая экспрессия GnRH-IR на нескольких злокачественных опухолевых клеток по сравнению со здоровыми тканями дает возможность для целенаправленной терапии 5, 6.
Многие гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ) аналоги были разработаны в течение последних нескольких десятилетий, которые могут быть использованы в качестве ориентации фрагментове "> 7, 8, 9. Эти пептиды способны доставить противораковые агенты с высокой селективностью в злокачественные опухолевые клетки , которые сверхэкспрессии GnRH-IR 6. Несколько ГнРГ конъюгированных противоопухолевых препаратов с более высокой селективностью и лучшей эффективностью , чем соответствующий неконъюгированный свободное лекарственное средство было зарегистрировано 7, 8, 9.
Предыдущие публикации о пептидов ГнРГ и их рецепторов сообщили , что ГнРГ-IR может принимать различные конформации , которые имеют различную селективность в отношении GnRH аналогов 10. Сильно варьирует GnRH-IR имеет сложные и различные сигнальные пути , наделены различной активностью в отношении их естественных и искусственных лигандов 11. Эти факты делают исследование систем ГнРГ на основе сложной. С другой стороны, у обладают многообещающим терапевтическим потенциалом. Несколько экспериментов с радиоактивно меченных пептидов ГнРГ ранее сообщалось о 12, 13, 14, 15, но эксперименты , в которых были использованы флуоресцентно меченных аналогов GnRH все еще ограничены. В то время как радиоактивное мечение обладает высокой чувствительностью, флуоресцентное мечение имеет ряд других преимуществ, например, более легкое обращение с ними, а также возможность контрастирующая с различными флуорофоров. Существует три основных аналогов GnRH , которые были успешно использованы для доставки лекарственных средств являются [D-Lys 6] -GnRH-я, [D-Lys 6] -GnRH-II и III-ГнРГ, однако эффективность этих пептидов в качестве целевые фрагменты , является редко по сравнению 16, 17. С другой стороны, результаты отдельных экспериментов, в которых использовались различные раковые клетки и аналоги ГнРГ разнообразен.
ntent "> Исходя из этих соображений, мы сосредоточились на опухоль ориентации и доставки лекарственного потенциала этих ГнРГ пептидов, и , таким образом , синтезированы и охарактеризованы в [D-Lys 6 (FITC)] – GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC )] – GnRH-II и в работе [Lys 8 (FITC)] – ГнРГ-III пептидных конъюгатов 18 Эти аналоги селективно меченных FITC на боковой цепи их Lys или D-Lys (отношение пептид-FITC 1: 1 в каждой из них . сопряженная). идея заключалась в том, что селективная флуоресцентная маркировка может предложить новую информацию об этих пептидов, а также позволяет их хорошей отслеживания и надежной количественной оценки. Эти конъюгаты имеют безопасное обращение и надежную выявляемость, которые делают его более легким, чтобы сравнить их эффективность ориентации опухоли, и скрининг многочисленных типов клеток злокачественных опухолей. Мы надеемся, что до-на сегодняшний день экспериментов с этими пептидных конъюгатов могут внести вклад в развитие нового рака ориентации конъюгаты GnRH-наркотиков, а также помочь идентифицировать новые терапевтические смолыполучает также.Настоящая рукопись демонстрирует некоторые хорошо воспроизводимые и быстрые эксперименты с ГнРГ-FITC конъюгатов. Экспрессия на поверхности клеток GnRH-R является определяющим состояние относительно поглощения ГнРГ, поэтому мы одновременно исследовали уровень клеточной поверхности GnRH-IR на тестируемых клеточных линиях. Мы визуализировали ГнРГ-IR и ГнРГ-FITC конъюгаты с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) и количественно оценивали клеточное поглощение ГнРГ-FITC конъюгатов с помощью флуоресцентной активированного сортировки клеток (FACS).
Protocol
Representative Results
Discussion
Эксперименты, описанные здесь используют селективно меченых аналогов ГнРГ для скрининга приверженца культуры клеток в пробирке. Конфокальной микроскопией и проточной цитометрии методы пригодны для отслеживания и количественной оценки клеточное поглощение этих ГнРГ-ФИТЦ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The project was supported by National Research Fund OTKA (K 104045).
Materials
| EBC-1 | JCRB Cell Bank | JCRB0820 | Human lung squamous cell carcinoma |
| BxPC-3 | ATCC | CRL-1687 | Human pancreatic adenocarcinoma |
| Detroit-562 | ATCC | CCL-138 | Human pharyngeal carcinoma |
| RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Lonza | BE12-702F | Culture medium for BxPC-3 cells |
| Eagle's Minimum Essential Medium | Lonza | BE12-611F | Culture medium for EBC-1 cells, and complemented with 0,1% sodium pyruvate for Detroit-562 cells |
| Fetal Bovine Serum | Euro Clone | ECS0180L | Complements the culture medium |
| MycoZap Plus-CL | Lonza | VZA-2012 | Complements the culture medium (antibiotics) |
| Standard Line Cell Culture Flasks | VWR | 10062-872 | Provide consistent, sterile growth environment for cells |
| Trypsin-EDTA Mixture | Lonza | BE17-161E | Remove attached cells |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | Solvent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Solvent |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Used to counting cells |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-I | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-II | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
| [Lys8(FITC)]-GnRH-III | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
| glass bottom 8-well microscopic slide | Ibidi | 80826 | Use in CLSM experiment |
| Corning Costar cell culture plate, 12 well | Sigma-Aldrich | CLS3513-50EA | Use in FACS experiment |
| Fixing solution (10% neutral buffered formalin) | Bio-Optica | 01V60P | Fix adherent cells |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-10G | Prevent the nonspecific binding of the antibodies |
| GnRHR Antibody | Proteintech | 19950-1-AP | Immunocytochemistry reagent, bind to the human type-I GnRH receptors |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A11035 | Immunocytochemistry reagent, bind to the primary antibody |
| Fluorescent probe solution (Draq5) | Thermo Fisher Scientific | 62254 | Counterstain nuclei |
| Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | Use in CLSM experiment, preserving fluorescence |
| Inverted microscope | Elektro-Optika Ltd. | Alpha XDS-2T | Check the phenotype and confluency of cell cultures |
| Inverted confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM-710 | Use in CLSM experiment |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur | Use in FACS experiment |
References
- Gilad, Y., Firer, M., Gellerman, G. Recent Innovations in Peptide Based Targeted Drug Delivery to Cancer Cells. Biomedicines. 4 (2), 11 (2016).
- Majumdar, S., Siahaan, T. J. Peptide-mediated targeted drug delivery. Med Res Rev. 32 (3), 637-658 (2012).
- Ramakrishnappa, N., Rajamahendran, R., Lin, Y. M., Leung, P. C. K. GnRH in non-hypothalamic reproductive tissues. Anim Reprod Sci. 88 (1-2), 95-113 (2005).
- Schally, A. V., et al. Hypothalamic hormones and cancer. Front Neuroendocrinol. 22 (4), 248-291 (2001).
- Limonta, P., et al. GnRH receptors in cancer: From cell biology to novel targeted therapeutic strategies. Endocr Rev. 33 (5), 784-811 (2012).
- Ma, Y. T., Zhou, N., Liu, K. L. Targeting drug delivery system based on gonadotropin-releasing hormone analogs: Research advances. J of Int Pharm Res. 41 (2), 140-148 (2014).
- Manea, M., et al. In-vivo antitumour effect of daunorubicin-GnRH-III derivative conjugates on colon carcinoma-bearing mice. Anti-Cancer Drugs. 23 (1), 90-97 (2012).
- Argyros, O., et al. Peptide-Drug conjugate gnrh-sunitinib targets angiogenesis selectively at the site of action to inhibit tumor growth. Cancer Res. 76 (5), 1181-1192 (2016).
- Karampelas, T., et al. GnRH-Gemcitabine conjugates for the treatment of androgen-independent prostate cancer: pharmacokinetic enhancements combined with targeted drug delivery. Bioconjug Chem. 25 (4), 813-823 (2014).
- Millar, R. P., Pawson, A. J., Morgan, K., Rissman, E. F., Lu, Z. -. L. Diversity of actions of GnRHs mediated by ligand-induced selective signaling. Front Neuroendocrinol. 29 (1), 17-35 (2008).
- Millar, R. P., et al. Gonadotropin-releasing hormone receptors. Endocr Rev. 25 (2), 235-275 (2004).
- Olberg, D. E., et al. Synthesis and in vitro evaluation of small-molecule [18F] labeled gonadotropin-releasing hormone (GnRH) receptor antagonists as potential PET imaging agents for GnRH receptor expression. Bioorg Med Chem Lett. 24 (7), 1846-1850 (2014).
- Zoghi, M., et al. Development of a Ga-68 labeled triptorelin analog for GnRH receptor imaging. Radiochimica Acta. 104 (4), 247-255 (2016).
- Guo, H., Gallazzi, F., Sklar, L. A., Miao, Y. A novel indium-111-labeled gonadotropin-releasing hormone peptide for human prostate cancer imaging. Bioorg Med Chem Lett. 21 (18), 5184-5187 (2011).
- Nederpelt, I., et al. Characterization of 12 GnRH peptide agonists – A kinetic perspective. Br J Pharmacol. 173 (1), 128-141 (2016).
- Szabo, I., et al. Comparative in vitro biological evaluation of daunorubicin containing GnRH-I and GnRH-II conjugates developed for tumor targeting. J Pept Sci. 21 (5), 426-435 (2015).
- Leurs, U., et al. GnRH-III based multifunctional drug delivery systems containing daunorubicin and methotrexate. Eur J Med Chem. 52, 173-183 (2012).
- Murányi, J., et al. Synthesis, characterization and systematic comparison of FITC-labelled GnRH-I, -II and -III analogues on various tumour cells. J Pept Sci. 22 (8), 552-560 (2016).
