Protokolle für die Untersuchung die Host-Gewebeverteilung, Transmission-Modus und Effekt auf der Host-Fitness eines Densovirus im Cotton Bollworm
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll der Host-Gewebeverteilung, Übertragungsmodus und Wirkung auf den Wirt Eignung eines densovirus innerhalb Lepidoptera-Spezies zu untersuchen, die Baumwollkapselwurm. Dieses Protokoll kann auch für die Untersuchung der Wechselwirkung zwischen anderen oral übertragenen Viren und ihren Insekten Wirten verwendet werden.
Abstract
Viele neue Viren wurden in Tierwirten unter Verwendung der nächsten Generation Sequenzierungstechnologien entdeckt. Zuvor berichteten wir ein mutualistic Virus, Helicoverpa armigera densovirus (HaDV2), in einer Lepidoptera – Spezies der Baumwollkapselwurm, Helicoverpa armigera (Hubner). Hier beschreiben wir die Protokolle, die derzeit verwendet werden, um die Wirkung von HaDV2 auf seinem Wirt zu studieren. Erstens haben wir eine HaDV2 freie Baumwollkapselwurm Kolonie aus einem einzigen Zuchtpaar etablieren. Dann wir mündlich einige Neugeborener Larven Nachkommen mit impfen filtrierte Flüssigkeit HaDV2 haltigen zwei Kolonien mit dem gleichen genetischen Hintergrund zu produzieren: ein HaDV2-infiziert ist, der andere nicht infizieren. Ein Protokoll zum Leben Tabellenparameter (zB Larven, Puppen und Erwachsener Zeiten und Fruchtbarkeit) zwischen den HaDV2-infizierten und -uninfected Individuen vergleichen wird ebenfalls vorgestellt, wie die Protokolle sind für die Host-Gewebeverteilung und Übertragungseffizienz von HaDV2 bestimmen. Diese Protokolle WOuld auch geeignet sein, die Wirkung anderer mündlich übertragene Viren auf ihren Insekten Gastgeber, Lepidoptera-Hosts insbesondere zu untersuchen.
Introduction
In den letzten Jahrzehnten hat sich die Entwicklung der Sequenzierungstechnologie wie Next-Generation – Sequencing (NGS) die Entdeckung vieler neuer DNA und RNA – Viren, vor allem nicht – pathogenen Viren erleichtert, sondern auch neue Isolate von bisher bekannten Viren 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. In dem Modellorganismus Drosophila melanogaster, mehr als 20 neue Teilvirusgenomen wurden unter Verwendung von 13 metagenomic Techniken nachgewiesen. Viele virale Sequenzen, einschließlich neuer Viren, wurden auch in anderen Insekten, wie Bienen, m identifiziertosquitoes, Asian citrus Psylliden, Libellen und mehrere Lepidoptera – Spezies 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21.
In Zukunft kann es, dass mehr neue Viren in Insekten entdeckt wird erwartet, dass diese erweiterten Technologien; damit unser Verständnis der Virus-Wirt – Interaktion kann entsprechend 6 ändern, 9. Zum Beispiel sind Virus-Wirt – Interaktionen als komplizierter sein als bisher angenommen, weil viele neue Viren als mutualistic Partner definiert werden , anstatt strenge Erreger 22. Zum Beispiel induziert der mutualistic densovirus DplDNV in Dysaphis plantaginea den geflügelten Morph und erhöht die Mobilität, die Zerstreuung des Wirtes sowie das Virus 23 zu erleichtern. Darüber hinaus wurden im Hinblick auf die Säugetier-Gesundheit, die Trockenheit und Kältetoleranz von Pflanzen, und die Auswirkungen von bakteriellen Infektionen 24 mutualistic Viren beschrieben. Seneca Tal – Virus-001 gezeigt selektive Zytotoxizität gegenüber Tumorzellen vermitteln mit neuroendokrinen Krebs 25 kennzeichnet. Hepatitis A – Virusinfektionen unterdrücken die Replikation von Hepatitis C Virus und können bis zur Erholung von Hepatitis – C – 26 führen. Herpes – Virus – Latenz verleiht symbiotischen Schutz vor bakterieller Infektion 27. Das Hüllglykoprotein von humanen endogenen Retrovirus HERV-W induziert zelluläre Resistenz gegen Milznekrosevirus 28. Curvularia Thermotoleranz-Virus (CThTV) aus einer Pilz Endophyt ist in der mutualistic Wechselwirkung zwischen diesem Pilze und einem tropischen panic Gras beteiligt"ref> 29. Daher Kenntnis der Wechselwirkungen zwischen den neu gefundenen Viren und ihren Wirten sollten neue Perspektiven auf ihre Biologie und Management generieren. Allerdings sind die neuen Viren, vor allem die versteckten Viren keine offensichtlichen Anzeichen typisch für eine akute Infektion anzeigt, haben selten wurden untersucht, und wir brauchen eine Pipeline und Protokolle, die Auswirkungen der neu gefundenen Viren auf ihren Wirten zu untersuchen.
Bisher haben wir die Prävalenz einen neuen monosense densovirus Helicoverpa armigera densovirus (HaDV2) in dem Baumwollkapselwurm, Helicoverpa armigera berichteten, und präsentierten Beweise für eine mutualistic Beziehung zwischen HaDV2 und dem Baumwollkapselwurm 30, 31. In diesem Beitrag werden wir das Laborprotokoll zu untersuchen im Detail die Interaktion zwischen HaDV2 und seinen Baumwolleule Host beschreiben. Das Protokoll hier vorgestellten kann auch von großer Bedeutung für Forscher, die r Prüfungole anderer Viren oral übertragen, vor allem in Lepidoptera-Schädlinge.
Protocol
Representative Results
Discussion
In den letzten Jahrzehnten sind die meisten Studien über Insekten-Virus – Interaktionen auf die Gesundheit Honigbiene 34 konzentriert haben, 35, 36, Vektoren der Krankheit beim Menschen 37, Viren Anlage 38, und einige insektenpathogenen Viren , die ein großes Potenzial haben als biologische Bekämpfungsmittel 39. Wenig Aufmerksamkeit wurde auf verdeckte V…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Key Grundlagenforschungsprogramm von China (Nr 2013CB127602) und der Wissenschaftsfond für kreative Forschungsgruppen von der National Science Foundation of China (Nr 31321004) unterstützt.
Materials
| 24-well plate | Corning | 07-200-740 | Multiple suppliers available. |
| DNA extraction kit | TIANGEN | DP304-03 | Multiple suppliers available. |
| thermal cycler | Veriti; Applied Biosystems | 4375786 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 0.22 µm membrane filter | Millipore | SLGS025NB | |
| pEASY-T Cloning Vector | TransGen, Beijing, China | CT301-02 | |
| Tweezers | IDEAL-TEK | 2.SA | |
| Premix Ex Taq (Probe qPCR) | Takara | RR390A | |
| Probes | Invitrogen | Custom order | |
| Primers | Invitrogen | Custom order | |
| microspectrophotometry NanoDrop 2000c | Thermo scientific | not available | |
| 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems | not available | |
| stereomicroscope SZX-16 | Olympus | not available | |
| sucrose | Multiple suppliers available. | ||
| vitamin complex | Multiple suppliers available. |
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