Terapötik Antikorlar Arasındaki Hedef Bağlanma ve CDC İndüksiyonunu Karşılaştırmak İçin İn Vitro Yöntemler: Biyoeşdeğerlik Analizindeki Uygulamalar
Summary
Bu protokol, rituksimab iki önemli fonksiyonel özellikleri in vitro karşılaştırmasını tarif: hedef bağlanma ve tamamlayıcıya bağlı sitotoksisite (CDC) indüksiyonu. yöntem, referans rituksimab ve rituksimab biyobenzerin arasında bir yan-yana karşılaştırma için kullanılmıştır. Bu tahliller, biyobenzer geliştirme sırasında veya üretimlerinde bir kalite kontrol olarak kullanılabilir.
Abstract
Terapötik monoklonal antikorlar (mAb), kanserler de dahil olmak üzere farklı patolojilerin tedavisi için önemlidir. İlaç şirketleri tarafından biyobenzer mAb'lerin gelişimi bir pazar fırsatıdır, ancak aynı zamanda uyuşturucunun erişilebilirliğini artırmak ve terapi ile ilişkili maliyetleri azaltmak için bir stratejidir. Burada detaylandırılan protokoller, Daudi hücrelerinde rituksimab ile hedef bağlanma ve CDC indüksiyonunun değerlendirilmesini tanımlamaktadır. Bu iki işlev antikorun farklı yapısal bölgelerini gerektirir ve rituximab'ın indüklediği klinik etkiyle ilişkilidir. Protokoller, bir referans rituksimabın ve piyasaya sürülen rituksimab biyosimerlerinin yan yana karşılaştırılmasını sağlar. Değerlendirilen ürünler hem hedef bağlama hem de CDC indüksiyonunda farklılıklar gösterdi; bu, alttaki fizikokimyasal farklılıkların bulunduğunu ve klinik ortamdaki bu farklılıkların etkisini analiz etme ihtiyacının altını çizdi. Burada bildirilen yöntemler basit ve ucuz in vitro </ Em> rituximab biyosimilar aktivitesinin değerlendirilmesi için modeller. Bu nedenle, biyo-benzeri gelişim sırasında biyoeşdeğer üretimin kalite kontrolünde yararlı olabilirler. Dahası, sunulan yöntemler diğer terapötik mAb'lara ekstrapole edilebilir.
Introduction
Terapötik antikorlar kanser, oto bağışıklık ve kronik hastalıklar, nörolojik hastalıklar ve diğerleri 1 de dahil olmak üzere, farklı patolojilerin tedavisi için geliştirilmiş rekombinant monoklonal antikorlar (mAb'ler) bulunmaktadır. Şu anda FDA 40'dan fazla terapötik mAb'lere onayını veren ve daha sonraki yıllarda pazara ulaşması bekleniyor.
Rituksimab CD20 + B hücreli non-Hodgkin lenfoma (NHL), CD20 + foliküler NHL, kronik lenfositik lösemi, ve romatoid artrit, 2, 3 tedavisi için onaylanmıştır yüksek afiniteli bir kimerik monoklonal IgG1 antikoru. rituksimab tarafından B hücrelerinde aşırı eksprese olan CD20 tanınması, apoptozu indükler; kompleman aktivasyonu; ve antikora bağlı hücre aracılı sitotoksisite (ADCC) 3. Bu ilacın patent 2013 ve 2016 yılında ABD'de, Avrupa'da ve süresi dolmuş, sırasıyla. Böylece, dünya çapındaki ilaç firmaları rituximab biyosimilar geliştiriyor. İnsan tüketimi için diğer herhangi bir ilacın olduğu gibi, biyosimilarlar da düzenleyici kurumların onayını gerektirir. Uluslararası yönergeler, mAb'ler için yeni ve referans ürünlerin fiziko kimyasal özellikleri, farmakokinetiği, etkililiği ve emniyetini karşılaştırarak biyolojik benzerliğin gösterilmesi gerektiğini göstermektedir.
Buna göre, bu karşılaştırmalarda kullanılan metodolojiler mAb'lerin yapısal ve işlevsel özelliklerini, özellikle de klinik önemi olanları değerlendirmelidir. Bu amaçla, in vitro deneyler in vivo deneylere kıyasla birçok avantaj sağlar (Chapman ve ark. Gözden geçirilir) 5 : i) in vitro çalışmalar önerilen biyobenzer ile referans ürün arasındaki farklara daha duyarlıdır; Ii) in vivo çalışmalar ilgili türlerde yapılmalıdır, ki bu birçok mAb içininsan olmayan primatlar; ve iii) hareket mekanizması, klinik öncesi toksikoloji ve referans ürün ile ilgili klinik etkileri itibaren de ek yararlı bilgiler sağlamayabilir biyobenzerlerin ile in vivo çalışmalar, bilinmektedir. Buna göre, biyobenzerleri için Avrupa Birliği'nin Rehberlik adayları vitro verilere yalnız 6'da sağlam dayalı klinik deneylere girmek için izin verir.
Burada, CD20 + kültürlü hücreleri kullanılarak rituksimab biyolojik aktivitesini değerlendirmek iki hızlı, ekonomik ve basit deneyleri sunuyoruz. Bu tahliller, rituksimab Biyobenzer adaylar için karşılaştırılabilirlik çalışmasının bir parçası olarak dahil edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Terapötik mAb'nin patent sona ermesi, biyosimilarların gelişimini desteklemektedir. Dolayısıyla, bu ürünlerin klinik olarak ilgili faaliyetlerindeki farklılıkları belirleyebilen basit yöntemlere ihtiyaç vardır. CD20 + kültürlü hücreler rituximabın iki önemli fonksiyonel özelliğinin değerlendirilmesi için kullanılmıştır: hedef bağlama ve CDC indüksiyonu. Önceki aktivite, CD20'nin mAb'nin Fab bölgesi tarafından tanınmasını gerektirirken, sonuncusu esasen Fc bölges…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarların onayları yok.
Materials
| RPMI-1640 medium | ATCC | 30-2001 | Modify the culture depending on the cell line |
| Trypan Blue solution | Sigma | T8154 | 0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Daudi Burkitt's Lymphoma Cells | ATCC | CCL-213 | You can modify the cell line depending on the antibody of interest |
| Fetal bovine serum(FBS) | GIBCO | 16000-044 | You can modify the source of serum depending of requirements of the cell line |
| Normal Human Serum Complement | Quidel | A113 | It is therefore appropriate for use in biocompatibility experiments including drug development, biomaterials testing and other applications |
| 7AA-D | BDPharmigen | 559925 | You can use broad range of color options, compatible with most instrument configurations for to analyze viability. |
| PECy5 Mouse Anti-human IgG | BDPharmigen | 551497 | Change fluorochrome depending on the filter and laser of your flow cytometer. |
| Human IgG Isotype Control | ThermoFisher Scientific | 07-7102 | Change depending to mAb |
| BDCytofix | BDPharmigen | 554655 | Flow Cytometry Fixation Buffer (1-4% formaldehyde or paraformaldehyde ) |
| PBS pH 7.4 10X (Phosphate buffer saline) | GIBCO | 70011-044 | Phosphatebuffer without Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4] and endotoxin free. |
| Cell culture plates 96 well, V-bottom | Corning | 29442-068 | 12 x 75 mm round bottom test tubes or 96-well V- or U- bottom microtiter plates |
| MabThera (Rituximab) | Roche | — | Reference product |
| Rituximab | Indian | — | Biosimilar product |
| 15- or 50-mL conical centrifuge tubes | Corning | 430290 or 430052 | — |
| Pipette Tips | Eppendorf | — | Multiple volume configurations are necessary |
| Pipettes | Eppendorf | — | Adjustable-volume pipettes are necessary |
| Centrifuge 5430/ 5430R model | Eppendorf | — | Refrigerated variable-speed centrifuge (4 to 25 ° C) with speeds ranging from 10 to 30,130 × g |
| Flow cytometer | BD Dickinson | — | BD FACSAria III or other flow cytometer |
| Olympus optical and light microscope | Olympus | — | To quantify and evaluate cell growth |
| Incubator | SANYO | — | Incubatorfor temperature andCO2 control to culture cells |
| Biological Safety Cabinet | CHC BIOLUS | — | Biological safety cabinet that is used to protect the researcher, product and environment. |
References
- Schimizzi, G. F. Biosimilars from a practicing rheumatologist perspective: An overview. Autoimmun Rev. 15 (9), 911-916 (2016).
- Cuello, H. A., et al. Comparability of Antibody-Mediated Cell Killing Activity Between a Proposed Biosimilar RTXM83 and the Originator Rituximab. Bio Drugs. 30 (3), 225-231 (2016).
- Iwamoto, N., et al. Validated LC/MS Bioanalysis of Rituximab CDR Peptides Using Nano-surface and Molecular-Orientation Limited (nSMOL) Proteolysis. Biol Pharm Bull. 39 (7), 1187-1194 (2016).
- Chapman, K., et al. Waiving in vivo studies for monoclonal antibody biosimilar development: National and global challenges. MAbs. 8 (3), 427-435 (2016).
- Zembruski, N. C., et al. 7-Aminoactinomycin D for apoptosis staining in flow cytometry. Anal Biochem. 429 (1), 79-81 (2012).
- Salinas-Jazmin, N., Hisaki-Itaya, E., Velasco-Velazquez, M. A. A flow cytometry-based assay for the evaluation of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) in cancer cells. Methods Mol Biol. 1165, 241-252 (2014).
- Teeling, J. L., et al. The Biological Activity of Human CD20 Monoclonal Antibodies Is Linked to Unique Epitopes on CD20. J Immunol. 177 (1), 362-371 (2006).
- Miranda-Hernandez, M. P., et al. Assessment of physicochemical properties of rituximab related to its immunomodulatory activity. J Immunol Res. 2015, 910763 (2015).
- Visser, J., et al. Physicochemical and functional comparability between the proposed biosimilar rituximab GP2013 and originator rituximab. BioDrugs. 27 (5), 495-507 (2013).
- Ylera, F., et al. Off-rate screening for selection of high-affinity anti-drug antibodies. Anal Biochem. 441 (2), 208-213 (2013).
- Broyer, L., Goetsch, L., Broussas, M. Evaluation of complement-dependent cytotoxicity using ATP measurement and C1q/C4b binding. Methods Mol Biol. 988, 319-329 (2013).
- Herbst, R., et al. B-cell depletion in vitro and in vivo with an afucosylated anti-CD19 antibody. J Pharm Exp Ther. 335 (1), 213-222 (2010).
- Lazar, G. A., et al. Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (11), 4005-4010 (2006).
- Winiarska, M., et al. Statins impair antitumor effects of rituximab by inducing conformational changes of CD20. PLoS medicine. 5 (3), e64 (2008).
- Zhou, X., Hu, W., Qin, X. The role of complement in the mechanism of action of rituximab for B-cell lymphoma: implications for therapy. Oncologist. 13 (9), 954-966 (2008).
- Hayashi, K., et al. Gemcitabine enhances rituximab-mediated complement-dependent cytotoxicity to B cell lymphoma by CD20 upregulation. Cancer Sci. 107 (5), 682-689 (2016).
- Mossner, E., et al. Increasing the efficacy of CD20 antibody therapy through the engineering of a new type II anti-CD20 antibody with enhanced direct and immune effector cell-mediated B-cell cytotoxicity. Blood. 115 (22), 4393-4402 (2010).
- Lapalombella, R., et al. A novel Raji-Burkitt’s lymphoma model for preclinical and mechanistic evaluation of CD52-targeted immunotherapeutic agents. Clin Cancer Res. 14 (2), 569-578 (2008).
- Mitoma, H., et al. Mechanisms for cytotoxic effects of anti-tumor necrosis factor agents on transmembrane tumor necrosis factor alpha-expressing cells: comparison among infliximab, etanercept, and adalimumab. Arthritis Rheum. 58 (5), 1248-1257 (2008).
- Kaymakcalan, Z., et al. Comparisons of affinities, avidities, and complement activation of adalimumab, infliximab, and etanercept in binding to soluble and membrane tumor necrosis factor. Clin Immunol. 131 (2), 308-316 (2009).
- Zent, C. S., et al. Direct and complement dependent cytotoxicity in CLL cells from patients with high-risk early-intermediate stage chronic lymphocytic leukemia (CLL) treated with alemtuzumab and rituximab. Leuk Res. 32 (12), 1849-1856 (2008).
- Goswami, M. T., et al. Regulation of complement-dependent cytotoxicity by TGF-beta-induced epithelial-mesenchymal transition. Oncogene. 35 (15), 1888-1898 (2016).
- Wang, A., et al. Induction of anti-EGFR immune response with mimotopes identified from a phage display peptide library by panitumumab. Oncotarget. , (2016).
- Ueda, N., et al. The cytotoxic effects of certolizumab pegol and golimumab mediated by transmembrane tumor necrosis factor alpha. Inflamm Bowel Dis. 19 (6), 1224-1231 (2013).
- Nesbitt, A., et al. Mechanism of action of certolizumab pegol (CDP870): in vitro comparison with other anti-tumor necrosis factor alpha agents. Inflamm Bowel Dis. 13 (11), 1323-1332 (2007).
- Teeling, J. L., et al. Characterization of new human CD20 monoclonal antibodies with potent cytolytic activity against non-Hodgkin lymphomas. Blood. 104 (6), 1793-1800 (2004).
