Парные шарик и магнит массив для литья Microwells с переменной геометрией вогнутый
Summary
Эта рукопись вводит надежный метод изготовления вогнутой microwells без необходимости в дорогостоящих объектов. Использование магнитных сил, стальных шариков и массив через отверстие, несколько сотен microwells были сформированы в подложке полидиметилсилоксан (PDMS) 3 x 3 см.
Abstract
Сфероида культура является полезным инструментом для понимания клеточного поведения в том, что он обеспечивает в естественных условиях-как трехмерной среде. Различные методы производства сфероида такие как non клей поверхностей, спиннер колбы, висит капли и microwells были использованы в исследованиях по вопросам взаимодействия в ячейке, иммунной активации, наркотиков скрининг, стволовых дифференцировки клеток и органоид поколения. Среди этих методов microwells с трехмерной геометрии вогнутой завоевали внимание ученых и инженеров, учитывая их преимущества единообразного размера сфероида поколения и легкость, с которой может быть ответы отдельных сфероидов мониторинг. Даже несмотря на то, что были предложены эффективные методы такие, как использование гибких оболочек и льда литографии, эти методы понести серьезные недостатки, такие как сложно контролировать размеры шаблона, достижение высоких пропорций и производство большие области microwells. Чтобы преодолеть эти проблемы, мы предлагаем надежный метод для изготовления вогнутой microwells без необходимости в дорогостоящих объектов. Этот метод использует массив через отверстие 30 x 30, несколько сотен микрометр порядка стали бусы и магнитные силы для изготовления 900 microwells в подложке полидиметилсилоксан (PDMS) 3 x 3 см. Чтобы продемонстрировать применимость нашего метода ячейку биологических приложений, мы культивировали жировых стволовых клеток для 3 дней и успешно производится с помощью нашей платформы микрорезервуар сфероидов. Кроме того мы провели магнитостатических моделирования для изучения механизма, согласно которому магнитная сила была использована для ловушку стальные шарики через отверстия. Мы считаем, что предлагаемый микрорезервуар изготовление метод может применяться для многих сотовых исследования, основанные на сфероиде таких наркотиков скрининг, регенерации тканей, дифференцировки стволовых клеток и рак метастазы.
Introduction
Клетки, превратилась в форму сфероида больше похожи на реальные ткани в организме, чем двумерной плоскости культуры1. Учитывая это преимущество, использование сфероидов был принят для улучшения деятельности по изучению взаимодействия в ячейке2,3, иммунной активации4, наркотиков скрининг5и6дифференциации. Кроме того недавно были применены к organoids (рядом физиологических трехмерные (3D) ткани), которые являются очень полезными для изучения человеческого развития и болезней7сфероидов, включающий несколько типов клеток. Некоторые методы были использованы для производства сфероидов. Простейший метод предполагает использование поверхности без клея, таким образом, что клетки агрегировать друг с другом и формы сфероидов. Петри блюдо можно лечить с бычьим сывороточным альбумином, плюрониевого F-127 или гидрофобный полимер (например поли 2-hydroxyethl метакрилат) сделать его поверхности не клей89. Спиннер фляжка метод является еще одним известным средством производства большого количества сфероидов10,11. В этом методе клетки проходят в подвеска, помешивая, чтобы помешать им стать присоединяется к подложке. Вместо этого плавающей клетки агрегат в форме сфероидов. Поверхности метод non клей и паук фляжка метод может производить большое количество сфероидов. Однако они действуют ограничения, включая трудности в контролировать размер сфероида, а также отслеживание и мониторинг каждого сфероида. Как средство для таких проблем, другой метод производства сфероида, а именно, висит падение метод может быть занятых12. Это включает в себя хранение клеток подвеска капель на внутренней стороне крышки культуры блюдо. Эти капли обычно 15-30 мкл в размерах и содержит около 300 до 3000 клетки13. Когда крышка инвертируется, капли проводятся в месте поверхностного натяжения. Условия микрогравитации в каждой капле концентрируется клетки, которые затем образуют единый сфероидов на интерфейсе свободной жидкости воздух. Преимущества висит метод drop являются, что он предлагает хорошо контролируемых размер распределения, хотя это легко отслеживать и контролировать каждый сфероида, по отношению к не клей поверхности и spinner колбу методы. Однако, этот метод создает один недостаток в том, что массовое производство сфероидов и сам процесс производства является чрезмерно труда интенсивный.
В микрорезервуар массив является плоской пластины с многих микро размера скважин, каждый диаметром от 100 до 1000 мкм. Принцип производства сфероида при использовании microwells похож на поверхности метода non клей. Преимущества включают в себя тот факт, что microwells обеспечивают пробелы между microwells для разделения клетки или сфероидов, таким образом, что это легко контролировать размер сфероида, а также делает его легко контролировать каждый один сфероида. С большое количество microwells также возможна сфероида высок объём производства. Еще одним преимуществом microwells является возможность формы колодцы различной формы (шестигранные, цилиндрические, тригональная призматических) в зависимости от уникальных экспериментальных целей пользователей. Как правило однако, трехмерные (3D) вогнутые (полусферической) фигуру или рассматривается как наиболее подходящие для производства единообразного размера одного сфероидов. Таким образом, полезность вогнутые microwells было сообщено для многих исследований биологии клетки таких изучения cardiomyocyte дифференциация14эмбриональных стволовых клеток, секрецию инсулин островковых клеток кластеров15, Ферментативная активность гепатоцитов16и резистентности опухоли сфероидов17.
К сожалению изготовление microwells часто требует специализированных micropatterning услуги; обычные методы на основе фотолитографии требуют облучения и развивающихся объектов, в то время как реактивного ионного травления-методы, основанные нуждаются плазмы и ионно лучевого оборудования. Такое оборудование является дорогостоящим, вместе с процессом изготовления сложных представляет высокий барьер для вступления для биологов, которые не имеют доступа к микротехнологии. Для преодоления этих проблем, другие эффективные методы такие, как лед литографии18 (с использованием замороженных водных капель) и гибкой мембраны метод14 (с помощью мембраны, через отверстие субстрата и вакуума) было предложено. Однако эти методы также понести серьезные недостатки, такие как трудно контролировать размеры шаблона, достижение высокой пропорции и производство большей площади microwells.
Для преодоления вышеуказанных вопросов, мы предлагаем метод изготовления Роман вогнутой микрорезервуар использованием подложке через отверстие, стальные шарики и массив магнит. С помощью этого метода, сотни вогнутой сферических microwells могут быть изготовлены, используя механизм магнитной силы оказали помощь самоблокирующихся металлические бусины (рис. 1). Процесс изготовления предполагает использование очень мало дорогих и сложных объектов и не требует многих передовых навыков. Таким образом даже неквалифицированных лиц можно легко провести этот метод изготовления. Для демонстрации использования предложенного метода, человека жировой производные стволовые клетки были культивировали в вогнутые microwells производить сфероидов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Основная задача этого метода изготовления был безопасной фиксации бусины в массиве через отверстие в алюминиевой пластине. Для решения этой задачи, исправить бисер надежно, как показано на рисунках 6 и 7был использован магнитная сила в виде массива магнит 30 x 30. Магнит?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано базовой программы исследований науки через национальных исследований фонда из Кореи (NRF) финансируется министерством науки, ИКТ и будущего планирования (СР 2014R1A1A2057527 и СР 2016R1D1A1B03934418).
Materials
| CNC rotary engraver | Roland DGA | EGX-350 | |
| Micro drill bit | HAM Präzision | 30-1301 TA | Φ 0.55 and 0.75 mm |
| Sulfuric acid 98% | Daejung | 7683-4100 | For cleaning aluminum plate. Dilute with distilled water with 15% solution |
| Neodymium magnet | Supermagnete | W-01-N | 1 x 1 x 1 mm |
| Bearing ball | Agami Modeling | SUJ2 | Φ 600 μm steel bead |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dowcorning | Sylgard 184 | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | p2443 | Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution |
| Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) | ATCC | 30-2200 | |
| Fetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | |
| Adipose-derived mesenchymal stem cells | ATCC | ATCC PCS-500-011 |
References
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).
- Djordjevic, B., Lange, C. S. Hybrid spheroids as a tool for prediction of radiosensitivity in tumor therapy. Indian J Exp Biol. 42 (5), 443-447 (2004).
- Takezawa, T., Yamazaki, M., Mori, Y., Yonaha, T., Yoshizato, K. Morphological and immuno-cytochemical characterization of a hetero-spheroid composed of fibroblasts and hepatocytes. J Cell Sci. 101 (3), 495-501 (1992).
- Gottfried, E., Kunz-Schughart, L. A., Andreesen, R., Kreutz, M. Brave little world: spheroids as an in vitro model to study tumor-immune-cell interactions. Cell Cycle. 5 (7), 691-695 (2006).
- Zhang, X., et al. Development of an in vitro multicellular tumor spheroid model using microencapsulation and its application in anticancer drug screening and testing. Biotechnol Prog. 21 (4), 1289-1296 (2005).
- Kim, B. C., et al. Microwell-mediated micro cartilage-like tissue formation of adipose-derived stem cell. Macromol Res. 22 (3), 287-296 (2014).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature cell biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Yuhas, J. M., Li, A. P., Martinez, A. O., Ladman, A. J. A simplified method for production and growth of multicellular tumor spheroids. Cancer Res. 37 (10), 3639-3643 (1977).
- Hamilton, G. A., Westmoreland, C., George, E. Effects of medium composition on the morphology and function of rat hepatocytes cultured as spheroids and monolayers. In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 37 (10), 656-667 (2001).
- Nyberg, S. L., et al. Rapid, large-scale formation of porcine hepatocyte spheroids in a novel spheroid reservoir bioartificial liver. Liver Transplant. 11 (8), 901-910 (2005).
- Lazar, A., et al. Extended liver-specific functions of porcine hepatocyte spheroids entrapped in collagen gel. In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 31 (5), 340-346 (1995).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Choi, Y. Y., et al. Controlled-size embryoid body formation in concave microwell arrays. Biomaterials. 31 (15), 4296-4303 (2010).
- Hwang, J. W., et al. Functional clustering of pancreatic islet cells using concave microwell array. Macromol Res. 19 (12), 1320-1326 (2011).
- Wong, S. F., et al. Concave microwell based size-controllable hepatosphere as a three-dimensional liver tissue model. Biomaterials. 32 (32), 8087-8096 (2011).
- Yeon, S. E., et al. Application of concave microwells to pancreatic tumor spheroids enabling anticancer drug evaluation in a clinically relevant drug resistance model. PloS one. 8 (9), (2013).
- Park, J. Y., Hwang, C. M., Lee, S. H. Ice-lithographic fabrication of concave microwells and a microfluidic network. Biomed Microdevices. 11 (1), 129-133 (2009).
- Corning, D. . Sylgard 184 Silicone Elastomer. Technical Data Sheet. , (2008).
- Giang, U. B. T., Lee, D., King, M. R., DeLouise, L. A. Microfabrication of cavities in polydimethylsiloxane using DRIE silicon molds. Lab on a Chip. 7 (12), 1660-1662 (2007).
- Choi, J. S., et al. Capture and culturing of single microalgae cells, and retrieval of colonies using a perforated hemispherical microwell structure. RSC Advances. 4 (106), 61298-61304 (2014).
- Zhong, K., Gao, Y., Li, F., Zhang, Z., Luo, N. Fabrication of PDMS microlens array by digital maskless grayscale lithography and replica molding technique. Optik. 125 (10), 2413-2416 (2014).
- Lai, D., et al. Simple multi-level microchannel fabrication by pseudo-grayscale backside diffused light lithography. RSC advances. 3 (42), 19467-19473 (2013).
- Pan, J., et al. Fabrication of a 3D hair follicle-like hydrogel by soft lithography. J Biomed MAter Res A. 101 (11), 3159-3169 (2013).
- Mori, R., Sakai, Y., Nakazawa, K. Micropatterned organoid culture of rat hepatocytes and HepG2 cells. J Biosci Bioeng. 106 (3), 237-242 (2008).
