Подготовка и характеристика новых HDL-имитирующих наночастиц для инкапсуляции фактора роста нервов
Summary
Простую гомогенизацию использовали для получения новых наночастиц с высокой плотностью, имитирующих липопротеин для инкапсуляции фактора роста нервов. В этой статье описываются проблемы, подробные протоколы для подготовки наночастиц, характеристика in vitro и исследования in vivo .
Abstract
Целью данной статьи является введение методов подготовки и характеризации наночастиц (NP), нагружающих фактор роста нервной (NGF), высокой плотности, липопротеинов (HDL). ЛПВП являются эндогенными НП и изучены в качестве носителей для доставки терапевтических агентов. Разработаны различные методы получения HDL-имитирующих НП. Однако они, как правило, сложны, трудоемки и трудны для промышленного наращивания. В этом исследовании одноступенчатую гомогенизацию использовали для смешивания эксципиентов и образования прототипов NPs. NGF представляет собой водорастворимый белок массой 26 кДа. Для облегчения инкапсулирования NGF в липидную среду HDL-имитирующих NPs протамин USP использовали для образования комплекса ионной пары с NGF для нейтрализации зарядов на поверхности NGF. NGF / протаминовый комплекс затем вводили в прототипы NPs. Наконец, аполипопротеин AI был нанесен на поверхность НП. NGF-HDL-имитирующие NPs показали предпочтительные свойства в терминахС размером частиц, распределением по размерам, эффективностью захвата, высвобождением in vitro , биологической активностью и биораспределением. Благодаря тщательной разработке и исследованию гомогенизации в HD-имитирующих NP, процедура была значительно упрощена, и NP были сделаны масштабируемыми. Кроме того, были преодолены различные проблемы, такие как отделение незагруженного NGF от NP, проведение надежных исследований высвобождения in vitro и измерение биоактивности NP.
Introduction
Макромолекулы, такие как белки, пептиды и нуклеиновые кислоты, появились в качестве перспективных препаратов и в последние десятилетия получили значительное внимание 1 , 2 . Благодаря их высокой эффективности и специфическим режимам действия они обладают большим терапевтическим потенциалом для лечения рака, иммунных заболеваний, ВИЧ и связанных с ними состояний 3 , 4 . Однако физико-химические свойства, такие как их большие молекулярные размеры, трехмерная структура, поверхностные заряды и гидрофильная природа, делают in vivo доставку этих макромолекул очень сложной. Это значительно затрудняет их клиническое применение 4 . Недавние достижения в системах доставки лекарственных средств, таких как микрочастицы, полимерные наночастицы (NP), липосомы и липидные NP, преодолели эти трудности и значительно улучшили доставку макромолекул in vivo . эйБыли выявлены некоторые недостатки в отношении этих доставочных грузов, включая низкую загрузочную способность лекарства, низкую эффективность улавливания, короткий период полураспада, потерю биоактивности и нежелательные побочные эффекты 5 , 6 , 7 , 8 . Эффективные системы носителей остаются областью исследования. Более того, разработка аналитических методов для характеризации нагруженных препаратами НП более сложна для макромолекул, чем для малых молекул.
Липопротеины высокой плотности (HDL) представляют собой природные NP, состоящие из липидного ядра, покрытого аполипопротеинами и монослоем фосфолипидов. Эндогенный ЛВП играет критическую роль в транспорте липидов, белков и нуклеиновых кислот посредством его взаимодействия с рецепторами-мишенями, такими как SR-BI, ABCAI и ABCG1. Он был изучен как средство доставки различных терапевтических агентов 9, 10 , 11 , 12 . Разработаны различные методы получения HDL-имитирующих НП. Диализ – популярный подход. В этом способе НЧ образуются путем гидратации липидной пленки с использованием раствора холата натрия. Затем соль удаляют посредством 2-дневного диализа с тремя буферами 13 . Способы ультразвуковой обработки производят НП путем ультразвуковой липидной смеси в течение 60 мин при нагревании; НЧ далее очищают с помощью гель-хроматографии 14 . Микрофлюиды генерируют НП с помощью микрожидкостного устройства, которое смешивает фосфолипиды и растворы аполипопротеина AI (Apo AI) путем создания микровихрей в фокусирующей схеме 15 . Очевидно, что эти методы могут быть трудоемкими, жесткими и трудными для промышленного наращивания.
В этой статье мы вводим подготовку и характеристику новых HDL-имитирующих NP для нерваИнкапсуляция фактора роста (NGF). NGF представляет собой дисульфидсвязанный полипептидный гомодимер, содержащий два полипептидных мономера 13,6 кДа. Была разработана новая методика получения НП путем гомогенизации с последующим инкапсулированием NGF в NP. NGF-HDL-имитирующие NP характеризовались по размеру частиц, распределению по размерам, дзета-потенциалу и выделению in vitro . Их биоактивность оценивали на разрастание нейритов в клетках РС12. Биораспределение NGF HDL-имитирующих НП сравнивали с биосферным свободным NGF после внутривенной инъекции у мышей.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом исследовании мы продемонстрировали простой метод приготовления HDL-имитирующих NP для инкапсуляции NGF. Были изучены различные системы доставки NP для доставки белков. В настоящее время многие препараты НП включают диализ, осаждение растворителя и гидратацию пленки. Эти процессы, к…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH R03 NS087322-01 до Dong, X.
Materials
| Recombinant Human Beta-NGF | Creative Biomart | NGF-05H | |
| L-a-Phosphatidylcholine (PC) | Avanti | 131601P | 95%, Egg, Chicken |
| Sphingomyelin (SM) | Avanti | 860062P | Brain, Porcine |
| Phosphatidylserine (PS) | Avanti | 840032P | Brain, Porcine |
| Cholesteryl oleate (CO) | Sigma | C9253 | |
| D-α-Tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS) | BASF | 9002-96-4 | Vitamin E Polyethylene Glycol Succinate |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | meets USP testing specifications |
| Apolipoprotein A1, Human plasma | Athens Research & Technology | 16-16-120101 | 1mg in 671 µl 10 mM NH4HCO3, pH 7.4 |
| Sepharose 4B-CL | Sigma | CL4B200 | Cross-linked agarose, gel filtration chromatography column filling material |
| Sandwich ELISA Kit for NGF | R&D system | DY008 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| RPMI-1640 medium | GE Healthcare Life Science | SH30096.02 | |
| Horse serum | GE Healthcare Life Science | SH30074.03 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10082147 | |
| PC12 cells | ATCC | CRL-1721 | |
| Rat tail collagen type I | Sigma | C3867 | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31414 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Benzethonium chloride | Sigma | B8879 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Homogenizer | Tekmar | T 25-S1 | |
| Delsa Nano HC particle analyzer | Beckman-Coulter | Delsa Nano HC | |
| Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device | Spectrum Laboratories | G235036 | Molecule Cutoff 300 kDa |
| Centrifuge | Eppendoff | 5424R | |
| Polytron homogenizer | Kinematica | PT 1200C | |
| DecapiCone | Braintree Scientific Inc. | DC-M200 |
References
- Bruno, B. J., Miller, G. D., Lim, C. S. Basics and recent advances in peptide and protein drug delivery. Ther Deliv. 4 (11), 1443-1467 (2013).
- Mo, Z. C., Ren, K., Liu, X., Tang, Z. L., Yi, G. H. A high-density lipoprotein-mediated drug delivery system. Adv Drug Deliv Rev. 106 (Pt A), 132-147 (2016).
- Lacko, A. G., Sabnis, N. A., Nagarajan, B., McConathy, W. J. HDL as a drug and nucleic acid delivery vehicle. Front Pharmacol. 6, 247-252 (2015).
- Vaishya, R., Khurana, V., Patel, S., Mitra, A. K. Long-term delivery of protein therapeutics. Expert Opin Drug Deliv. 12 (3), 415-440 (2015).
- Lasic, D. D., Papahadjopoulos, D. . Medical application of liposomes. , (1998).
- Samad, A., Sultana, Y., Aqil, M. Liposomal drug delivery systems: an update review. Curr Drug Deliv. 4 (4), 297-305 (2007).
- Bezemer, J. M., Radersma, R., Grijpma, D. W., Dijkstra, P. J., van Blitterswijk, C. A., Feijen, J. Microspheres for protein delivery prepared from amphiphilic multiblock copolymers: 2. Modulation of release rate. J Control Release. 67 (2-3), 249-260 (2000).
- Patel, A., Patel, M., Yang, X., Mitra, A. K. Recent advances in protein and peptide drug delivery: a special emphasis on polymeric nanoparticles. Protein Pept lett. 21 (11), 1102-1120 (2014).
- Kuai, R., Li, D., Chen, Y. E., Moon, J. J., Schwendeman, A. High-density lipoproteins: nature’s multifunctional nanoparticles. ACS Nano. 10 (3), 3015-3041 (2016).
- Gursky, O. Structural stability and functional remodeling of high-density lipoproteins. FEBS Lett. 589 (19 Pt A), 2627-2639 (2015).
- McMahon, K. M., Thaxton, C. S. High-density lipoproteins for the systemic delivery of short interfering RNA. Expert Opin Drug Deliv. 11 (2), 231-247 (2014).
- McMahon, K. M., Foit, L., Angeloni, N. L., Giles, F. J., Gordon, L. I., Thaxton, C. S. Synthetic high-density lipoprotein-like nanoparticles as cancer therapy. Cancer Treat Res. 166, 129-150 (2015).
- Lerch, P. G., Förtsch, V., Hodler, G., Bolli, R. Production and characterization of a reconstituted high density lipoprotein for therapeutic applications. Vox Sang. 71 (3), 155-164 (1996).
- Zhang, Z., Chen, J., Ding, L., Jin, H., Lovell, J. F., Corbin, I. R., Cao, W., Lo, P. C., Yang, M., Tsao, M. S., Luo, Q., Zheng, G. HDL-mimicking peptide-lipid nanoparticles with improved tumor targeting. Small. 6 (3), 430-437 (2010).
- Kim, Y., Fay, F., Cormode, D. P., Sanchez-Gaytan, B. L., Tang, J., Hennessy, E. J., Ma, M., Moore, K., Farokhzad, O. C., Fisher, E. A., Mulder, W. J., Langer, R., Fayad, Z. A. Single step reconstitution of multifunctional high-density lipoprotein-derived nanomaterials using microfluidics. ACS Nano. 7 (11), 9975-9983 (2013).
- Prathipati, P., Zhu, J., Dong, X. D. Development of novel HDL-mimicking α-tocopherol-coated nanoparticles to encapsulate nerve growth factor and evaluation of biodistribution. Eur J Pharm and Biopharm. 108, 126-135 (2016).
