Approche précise de l'ablation cellulaire pour la modélisation des lésions rénales aiguës dans le développement du poisson zèbre
Summary
Ce travail présente un nouveau modèle in vivo de lésions rénales segmentaires utilisant du poisson zèbre transgénique GFP rénal. Le modèle permet l'induction de l'ablation ciblée des cellules épithéliales rénales pour montrer les mécanismes cellulaires des lésions et des réparations de néphron.
Abstract
La lésion rénale aiguë (IRA) est une affection médicale commune avec un taux de mortalité élevé. Avec les capacités de réparation du rein, il est possible de restaurer une fonction rénale adéquate après un traitement de soutien. Cependant, une meilleure compréhension de la mort et de la réparation des cellules néphrones au niveau cellulaire est nécessaire pour minimiser la mort cellulaire et pour améliorer le processus de régénération. Le pronephros du poisson zombi est un bon système modèle pour atteindre cet objectif car il contient des segments anatomiques similaires à ceux du néphron des mammifères. Auparavant, le modèle de la gentamicine pharmacologique était le modèle le plus courant utilisé pour étudier les lésions rénales chez les poissons. Cependant, ce modèle ne permet pas un contrôle spatiotemporel précis des blessures, et il est donc difficile d'étudier les processus cellulaires et moléculaires impliqués dans la réparation des reins. Pour surmonter cette limitation, ce travail présente une méthode par laquelle, contrairement à l'approche de la gentamicine, une protéine Fuorecent verte verte (GFP)Le pressage du groupe néphron peut être mis en photo à l'aide d'une lumière laser violette (405 nm). Ce nouveau modèle d'AKI offre de nombreux avantages qu'est d'autres méthodes de lésion épithéliale. Ses principaux avantages sont la capacité de «composer» le niveau de blessure et le contrôle spatiotemporel précis dans le modèle animal robuste in vivo . Cette nouvelle méthode permet d'améliorer considérablement le niveau de compréhension des mécanismes de réparation des blessures rénales et des réparations.
Introduction
Les lésions rénales aiguës (LIR) 1 , 2 , qui peuvent également être appelées insuffisance rénale aiguë, sont largement définies comme une altération soudaine de la fonction rénale 3 . Bien que le niveau de compréhension de cette condition ait été remarquablement remarquable au cours des années, les taux de morbidité et de mortalité sont restés élevés 1 , 2 . Le traitement actuel pour cette condition est principalement favorable, car les résultats de plusieurs essais cliniques de traitement médicamenteux ont été négatifs 4 , 5 . Le rein est unique car il a la capacité de se réparer. Par conséquent, la thérapie de soutien après un diagnostic précoce d'IRA est le meilleur moyen de limiter la morbidité 6 . Cependant, il est difficile de détecter l'IRA tôt, et le taux de mortalité est de 50 à 80% décroissant chez ceux qui ont besoin de dialyse 5. Avec la capacité des reins de se réparer et le manque d'options de traitement pour cette condition, il est important de développer des méthodes pour améliorer ce processus de régénération de néphron.
Il y a eu beaucoup de modèles différents utilisés pour la recherche AKI qui comprend différents agents de blessures et modèles animaux. En termes d'agents de lésions rénales, l'antibiotique aminoglycoside gentamicine a été utilisé comme agent néphrotoxique qui conduit à l'IRA 7 , 8 . Cependant, plusieurs groupes ont constaté que le traitement de gentamicine est mortel pour l'embryon de poisson zèbre 9 . Cela provoque des dommages tubulaires trop graves pour la récupération des embryons, rendant l'étude de la régénération difficile sans intervention. Les modèles de mammifères, comme la souris et le rat, sont également considérés comme précieux, mais ils font face à de nombreuses limitations lors de l'étude de l'IRA. Peut-être le principal inconvénient des modèles de rongeurs est la difficulté de visuaLisant le rein des rongeurs et déterminant ainsi les processus spatiotemportaux précis menant à la mort épithéliale et à la réparation.
Johnson et al. Ont rapporté une technique à base d'ablation au laser pour induire une lésion rénale aiguë chez le poisson zèbre embryonnaire et larvaire 9 . Ils ont utilisé une ablation laser pulsée pour endommager le rein après une injection intramusculaire avec des conjugués de dextrane. La fluorescence des conjugués de dextrane permet de visualiser les dommages et la régénération dans l'épithélium des tubules 9 . Ce modèle surmonte les deux limitations mentionnées ci-dessus, mais cela ne permet pas de niveaux de blessure graduels et est difficile à réaliser sur de grands groupes de cellules arbitraires.
Le nouveau modèle d'AKI à base d'ablation par laser à base d'ablation décrit ici répond à toutes les limitations ci-dessus. Le rein pronephrique dans le poisson zèbre larvaire est un organe mature et fonctionnel qui contient des segments semblables à ceux de la mammifèrePhron, y compris un glomérule, des tubules proximaux et distal, et un conduit collecteur 10 . Les larves de zébrés sont également optiquement transparentes, ce qui permet d'observer le rein à l'aide de techniques de fluorescence. Ainsi, le poisson zèbre est un modèle précieux in vivo de l'IRA, et le rein pronephrique larvaire (5-12 jours après la fertilisation (dpf)) peut être utilisé pour étudier les processus cellulaires et moléculaires impliqués dans les lésions rénales et la réparation.
Cet article présente une méthode par laquelle des protéines Green Fluorescent Protein (GFP) – exprimant des segments de néphron peuvent être mises en photo à l'aide d'une lumière laser violette à faible énergie (par rapport à un système à laser pulsé) (405 nm). La fluorescence GFP permet de cibler un groupe de cellules, ce qui rend les changements qui se produisent visibles grâce à l'observation du photoblanchiment GFP. En outre, la GFP (en absorbant la lumière violette) sert d'évier d'énergie pour potentialiser la blessure dans les cellules rénales exprimant la GFP. Micros à temporisationLa copie peut ensuite être utilisée pour étudier le processus de réparation. Des études ont révélé que la prolifération cellulaire, la migration cellulaire et la métaplasie cellulaire 11 , 12 , 13 sont des processus potentiels qui peuvent jouer un rôle important dans la réparation des reins. Cependant, l'importance relative de ces processus et les détails de leur interaction ont été difficiles à découvrir en raison des limites des modèles existants d'AKI. En utilisant cette approche novatrice, il a été possible de montrer que la migration cellulaire joue un rôle central dans la réparation des reins après une blessure aiguë 14 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Il convient de noter que la puissance laser totale varie selon les systèmes. Cependant, l'utilisation du pourcentage de photobloc GFP permet de lire l'énergie totale livrée au rein fluorescent, indépendamment de la variation de l'énergie laser et compensée par la durée d'exposition. Cependant, gardez à l'esprit que la réponse des différents tissus à cette méthode de photoablation varie. Même pendant la maturation des reins, il est significativement plus difficile d'obtenir une réduc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier le Dr Iain Drummond et le Dr Vladimir Korzh pour avoir partagé des lignes transgéniques GFP rénales. Nous souhaitons également remercier NYITCOM de fournir les ressources nécessaires pour mener à bien ce travail. Cette étude a été partiellement soutenue par des subventions: K08DK082782, R03DK097443 (NIH), et HSCI Pilot Grant (AV).
Materials
| Petri Dishes, 35 x 10mm | Genesee Scientific | 32-103 | Procedural Usage: Step 2.4,2.7 |
| Petri Dishes, 100 x 15mm | Midwest Scientific | 910 | Procedural Usage: Step 1 |
| De-chorination forceps- Electron Microscopy Sciences Dumont Tweezers 5 Dumostar | Fischer Scientific | 50-241-57 | Procedural Usage: Step 2.1.1 |
| Plastic Transfer Pipet | Globe Scientific | 135030 | Procedural Usage: Step 2.5, 3.6 |
| Tricaine | Sigma Aldrich | A5040-25G | Procedural Usage: Step 2.3, 3.4 |
| Agarose | Fischer Scientific | BP165-25 | Procedural Usage: Step 2.3 |
| Pulled glass probe (manufactured manually from glass capillary tubes) | Fischer Scientific | 21-1640-2C | Procedural Usage: Step 2.4 |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | Procedural Usage: Step 1.5 |
| SOLA Light Engine | Lumencor | SOLA SM-5-LCR-SB | Procedural Usage: Step 1.5 |
| Eclipse C2 Plus Confocal Microscope System | Nikon | Procedural Usage: Step 3 | |
| 1x E3 Solution | Recipe used to generate: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl 2 , 0.33 mM MgSO 4 Procedural Step Usage: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3 | ||
| PTU | Sigma | P7629-10G | Procedural Step Usage: 1.3, 2.2, 3.4, and 4.2 |
| NIS Elements Software | Nikon | C2+ | Procedural Usage: Step 3 |
| Laser Unit | Agilent | MLC 400 | Procedural Step 3.11 |
| Propidium Iodide | Sigma Aldrich | P4170-100MG | Procedural Step Usage: 4.2 |
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