ゼブラフィッシュの発生における急性腎障害のモデル化のための正確な細胞除去法
Summary
この研究は、腎臓GFPトランスジェニックゼブラフィッシュを用いた分節型腎障害の新しいインビボモデルを提示する。このモデルは、腎上皮細胞の標的アブレーションの誘導を可能にし、ネフロン傷害および修復の細胞機構を示す。
Abstract
急性腎臓傷害（AKI）は、高い死亡率を有する一般的な病状である。腎臓の修復能力により、支持療法後に適切な腎機能を回復させることが可能である。しかし、細胞死を最小限に抑え、再生プロセスを強化するためには、細胞レベルでネフロン細胞の死滅および修復がどのように起こるかをより良く理解することが必要である。 zebrafish pronephrosは、哺乳動物ネフロンに類似した解剖学的セグメントを含むため、この目標を達成するための良いモデルシステムです。以前は、魚の腎障害を研究するために使用された最も一般的なモデルは、薬理学的ゲンタマイシンモデルであった。しかしながら、このモデルは、損傷の正確な時空間制御を可能にせず、したがって、腎臓修復に関与する細胞プロセスおよび分子プロセスを研究することは困難である。この制限を克服するために、この研究は、ゲンタマイシンアプローチとは対照的に、特定の緑色蛍光タンパク質（GFP）-ex青色レーザ光（405nm）を用いてネフロンセグメントをプレスすることができる。このAKIの新規モデルは、上皮損傷の他の方法が欠けている多くの利点を提供する。その主な利点は、強いインビボ動物モデルにおいて、損傷レベルと正確な時空間制御を「ダイヤル」する能力である。この新しい方法は、腎障害および修復機構の理解のレベルを有意に高める可能性を有する。
Introduction
急性腎不全とも呼ばれる急性腎障害（AKI） 1,2 は、腎機能の突然の障害として広く定義されている3 。この状態の理解のレベルは長年にわたって著しく向上しているが、罹患率と死亡率は高いままである 1,2 。この状態の現在の治療法は、薬物治療の複数の臨床試験の結果が陰性であったため、ほとんど支持的である4,5 。腎臓は、それ自身を修復する能力を有する点で独特である。したがって、AKIの早期診断後の支持療法は、罹患率を制限する最良の方法である6 。しかし、早期にAKIを検出することは困難であり、死亡率は透析が必要な患者では50-80％。腎臓が自分自身を修復する能力およびこの状態の治療選択肢の欠如により、このネフロン再生プロセスを強化する方法を開発することが重要である。
傷害や動物モデルのさまざまなエージェントを含むAKIの研究に使用される多くの異なるモデルがありました。腎臓障害の薬剤に関して、アミノグリコシド抗生物質ゲンタマイシンは、AKI7,8に至る腎毒性剤として使用されている。しかし、いくつかのグループは、ゲンタマイシン処理がゼブラフィッシュ胚9に対して致命的であることを見出した。それは、胚の回復にはあまりにも深刻な管状の損傷を引き起こし、何らかのタイプの介入なしに再生の研究を困難にする。マウスやラットのような哺乳類のモデルも貴重だと考えられていますが、AKIの研究では多くの制限があります。おそらく、げっ歯類モデルの主な欠点は、視覚障害げっ歯類の腎臓を結紮し、上皮の死および修復に至る正確な時空間的過程を決定する。
Johnson ら胚および幼生のゼブラフィッシュにおいて急性腎障害を誘発するためのレーザーアブレーションベースの技術を報告している9 。彼らは、デキストラン結合体を筋肉内注射した後、腎臓に損傷を与えるためにパルスレーザーアブレーションを使用した。デキストラン結合体からの蛍光は、細管上皮9の損傷および再生の可視化を可能にする。このモデルは、上記の2つの制限を克服するが、傷害の段階的なレベルを許容せず、大きな、任意の細胞群で実施することは困難である。
ここに記載されているAKIの新しいレーザーアブレーションベースのゼブラフィッシュモデルは、上記のすべての制限に対応しています。幼虫ゼブラフィッシュの前腎臓腎臓は成熟した機能的器官であり、哺乳類のne糸球体、近位および遠位尿細管、および収集ダクト10を含む 。ゼブラフィッシュの幼虫もまた光学的に透明であり、蛍光技術によって腎臓を観察することが可能になる。したがって、ゼブラフィッシュは、AKIの貴重なインビボモデルであり、幼生期腎臓（受精後5〜12日）は、腎臓傷害および修復に関与する細胞および分子プロセスを研究するために使用することができる。
この論文では、特定の緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するネフロンセグメントを、低エネルギー（パルスレーザシステムと比較して）紫色レーザ光（405nm）を用いて光結合させる方法を提示する。 GFP蛍光は、細胞のグループの標的化を可能にし、GFP光退色の観察によって可視化される変化を生じさせる。さらに、GFP（紫色光を吸収することによって）は、GFP発現腎細胞における損傷を増強するエネルギーシンクとして働く。時差マイクロコピーを使用して修復処理を調べることができます。研究により、細胞増殖、細胞移動、および細胞化生11,12,13がすべて腎臓修復において重要な役割を果たす可能性のあるプロセスであることが判明している。しかし、これらのプロセスの相対的重要性とその相互作用の詳細は、AKIの既存モデルの限界のために明らかにすることは困難でした。この新規アプローチを用いて、急性損傷後の腎臓修復において細胞移動が中心的役割を果たすことを示すことが可能であった14 。
Protocol
Representative Results
Discussion
全レーザ出力はシステムによって異なることに留意されたい。しかし、％GFP光退色を使用すると、レーザー出力の変動とは無関係に、蛍光腎臓に送達され、暴露の長さによって補償される総エネルギーの読み出しが可能になる。しかし、この光切除法に対する異なる組織の応答は様々であることに留意してください。腎臓の成熟中でさえ、成熟した幼虫よりも若い胚でGFP蛍光の50％の減少を?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
腎臓のGFPトランスジェニック系統を共有してくださったIain Drummond博士とVladimir Korzh博士に感謝したいと思います。 NYITCOMにもこの作業を行うために必要なリソースを提供していただき、ありがとうございます。この研究の一部は、K08DK082782、R03DK097443（NIH）、およびHSCIパイロットグラント（AV）の助成金によって一部サポートされました。
Materials
| Petri Dishes, 35 x 10mm | Genesee Scientific | 32-103 | Procedural Usage: Step 2.4,2.7 |
| Petri Dishes, 100 x 15mm | Midwest Scientific | 910 | Procedural Usage: Step 1 |
| De-chorination forceps- Electron Microscopy Sciences Dumont Tweezers 5 Dumostar | Fischer Scientific | 50-241-57 | Procedural Usage: Step 2.1.1 |
| Plastic Transfer Pipet | Globe Scientific | 135030 | Procedural Usage: Step 2.5, 3.6 |
| Tricaine | Sigma Aldrich | A5040-25G | Procedural Usage: Step 2.3, 3.4 |
| Agarose | Fischer Scientific | BP165-25 | Procedural Usage: Step 2.3 |
| Pulled glass probe (manufactured manually from glass capillary tubes) | Fischer Scientific | 21-1640-2C | Procedural Usage: Step 2.4 |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | Procedural Usage: Step 1.5 |
| SOLA Light Engine | Lumencor | SOLA SM-5-LCR-SB | Procedural Usage: Step 1.5 |
| Eclipse C2 Plus Confocal Microscope System | Nikon | Procedural Usage: Step 3 | |
| 1x E3 Solution | Recipe used to generate: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl 2 , 0.33 mM MgSO 4 Procedural Step Usage: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3 | ||
| PTU | Sigma | P7629-10G | Procedural Step Usage: 1.3, 2.2, 3.4, and 4.2 |
| NIS Elements Software | Nikon | C2+ | Procedural Usage: Step 3 |
| Laser Unit | Agilent | MLC 400 | Procedural Step 3.11 |
| Propidium Iodide | Sigma Aldrich | P4170-100MG | Procedural Step Usage: 4.2 |
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