Tranches de coeur ventriculaire à courte aiguille murine pour études électrophysiologiques
Summary
Ici, nous décrivons la préparation de tranches ventriculaires viables à partir de souris adultes et leur utilisation pour des enregistrements de potentiel d'action des électrodes pointues. Ces préparations multicellulaires fournissent une structure tissulaire similaire in vivo , ce qui en fait un modèle précieux pour les études électrophysiologiques et pharmacologiques in vitro .
Abstract
Les cardiomyocytes murins ont été largement utilisés pour des études in vitro de la physiologie cardiaque et de nouvelles stratégies thérapeutiques. Cependant, les préparations multicellulaires de cardiomyocytes dissociés ne sont pas représentatives de la structure complexe in vivo des cardiomyocytes, des non myocytes et de la matrice extracellulaire, ce qui influence les propriétés mécaniques et électrophysiologiques du cœur. Nous décrivons ici une technique pour préparer des tranches ventriculaires viables de coeurs de souris adultes avec une structure de tissu préservée in vivo et démontrer leur aptitude à des enregistrements électrophysiologiques. Après l'excision du cœur, les ventricules sont séparés des oreillettes, perfusés avec une solution exempte de Ca2 + contenant du monoxime de 2,3-butanedione et incorporés dans un bloc d'agarose à faible teneur en masse fondue à 4%. Le bloc est placé sur un microtome avec une lame vibrante, et des tranches de tissu avec une épaisseur de 150 à 400 μm sont préparées en gardant la fréquence de vibrationDe la lame à 60-70 Hz et de déplacer la lame vers l'avant aussi lentement que possible. L'épaisseur des tranches dépend de l'application supplémentaire. Les tranches sont stockées dans la solution de Tyrode glacée avec 0,2 mM Ca 2+ et 2,3-butanedione monoxime (BDM) pendant 30 minutes. Ensuite, les tranches sont transférées à 37 ° C de DMEM pendant 30 minutes pour laver le BDM. Les tranches peuvent être utilisées pour des études électrophysiologiques avec des électrodes tranchées ou des réseaux de micro-électrodes, pour des mesures de force pour analyser la fonction contractile ou pour étudier l'interaction des cardiomyocytes et des tissus hôte présents dans les cellules souches transplantées. Pour les enregistrements d'électrodes pointues, une tranche est placée dans un plat de culture cellulaire de 3 cm sur la plaque chauffante d'un microscope inversé. La tranche est stimulée par une électrode unipolaire, et les potentiels d'action intracellulaire des cardiomyocytes dans la tranche sont enregistrés avec une électrode en verre tranchant.
Introduction
Des tranches de tissus minces ont été utilisées fréquemment dans la science fondamentale puisque Yamamot et Mcllwain ont montré en 1966 que l'activité électrique des tranches de cerveau est maintenue in vitro 1 . Depuis lors, des études électrophysiologiques et pharmacologiques ont été effectuées sur tranches de cerveau 2 , foie 3 , poumon 4 et tissu myocardique 5 , 6 , 7 . Les premiers enregistrements de pince-patch dans les tranches ventriculaires à partir de coeurs de rat néonataux ont été décrits en 1990 8 , mais cette technique est tombée dans l'oubli pendant un certain temps. Plus d'une décennie plus tard, notre groupe a mis au point une nouvelle méthode pour préparer des morceaux de coeur 11 embryonnaires murins, néonatals 10 et adultes. Ces tranches de tissus viables peuvent être utilisées pour des expériences aiguës (tranche pour adultesS peut être cultivé pendant plusieurs heures) ou des expériences culturelles à court terme (les tranches embryonnaires et néonatales peuvent être cultivées pendant quelques jours). Les tranches montrent in vivo, comme les caractéristiques électrophysiologiques et une propagation d'excitation homogène, comme l'ont évalué par un fort potentiel d'action des électrodes et des enregistrements de micro-électrodes 11 . En raison de leur morphologie «bidimensionnelle», ils permettent l'accès direct des électrodes d'enregistrement à toutes les régions du ventricule, ce qui en fait un outil intéressant pour les recherches électrophysiologiques et soulève de nouvelles options expérimentales par rapport aux coeurs entiers perfusés de Langendorff. La réponse médicamenteuse des tranches aux bloqueurs des canaux ioniques comme le verapamil (bloqueur de canal Ca 2+ ), le lidocain (bloqueur de canal Na + ), la 4-aminopyridine (inhibiteur de canal K + non sélectif dépendant de la tension) et la linopirdine (KCNQ K + -channel blocker) 9 , 11 </suP> correspond à des effets connus sur les cardiomyocytes dissociés. Les mesures de force isométrique ont révélé une relation de force fréquente positive et ont fortement suggéré une fonction contractile intacte 10 . Ces résultats ont démontré que les tranches ventriculaires murines conviennent comme un modèle tissulaire in vitro pour des études physiologiques et pharmacologiques. En outre, les tranches ventriculaires de coeurs récepteurs en combinaison avec des enregistrements d'électrodes pointues se sont révélées être un outil très utile pour caractériser l'intégration électrique et mécanique ainsi que la maturation des 12 cardiomyocytes dérivés de cellules 12 , 13 et 14 transplantés.
En résumé, les tranches ventriculaires sont un modèle de tissu multicellulaire précieux et bien établi et devraient être considérées comme complémentaires de cardiomyocytes dissociés et de coeurs perfusés de LangendorffDans la recherche cardiovasculaire, avec l'avantage majeur de fournir une structure tissulaire in vivo (contrairement aux cellules dissociées) ainsi que l'accès direct aux technologies de mesure, comme les enregistrements d'électrodes nettes à toutes les régions du cœur (contrairement aux préparations de coeur entier).
Protocol
Representative Results
Discussion
Les tranches ventriculaires permettent des études électrophysiologiques, pharmacologiques et mécaniques avec une structure tissulaire in vivo préservée et un accès direct de la technologie de mesure à toutes les régions du cœur. Les propriétés potentielles d'action physiologique ont été démontrées dans les tranches embryonnaires, néonatales et adultes 9 , 10 , 11 . La vitalité des tranches, à l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous reconnaissons le soutien fourni par les ateliers et l'établissement animal de l'Institut de neurophysiologie. Ce travail a été soutenu par Walter und Marga Boll-Stiftung, Köln Fortune et Deutsche Stiftung für Herzforschung.
Materials
| Leica VT 1000s | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | Microtome with vibrating blade. | |
| Stainless Steel Blades | Campden Instruments, Loughborough, England | 7550-1-SS | |
| Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | Z627992 | |
| Fine brush, e.g. size 6 (4/32") | VWR, International, Radnor, USA | 149-2125 | |
| Preparation table | self made | ||
| Molt for embedding ventricles in agarose | self made | ||
| 1 ml Syringe | Becton, Dickinson; Franklin Lakes, USA | 300013 | |
| 27Gx3/4“ Needles | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
| 20G 11/2“ Needles | 4657519 | ||
| Small scissor | WPI, Sarasota, USA | 501263 | |
| Tweezers #5, 0.1 x 0.06 mm tip | WPI, Sarasota, USA | 500342 | |
| Oxygen gas (medical grade O2) | Linde, Munich, Germany | ||
| Carbogen gas (95 % O2, 5 % CO2) | Linde, Munich, Germany | ||
| NaCL | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 7647-14-5 | |
| KCL | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746436 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746495 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | NIST200B | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 51558 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S5761 | |
| D(+)-Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | G8270 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | M7506 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S8045 | |
| Cyanoacrylate glue | Henkel, Düsseldorf, Germany | ||
| Low-melt Agarose | Roth, Karlsruhe, Germany | 6351.2 | |
| Heparin-sodium-25000 I.E./5mL | Ratiopharm, Ulm, Germany | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX | ThermoScientific, Waltham, USA | 10566016 | |
| SEC-10LX Amplifier | npi electronic GmbH, Tamm, Germany | SEC-10LX | |
| EPC 9 | HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Germany | ||
| Zeiss Axiovert 200 | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
| Low magnification Micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | Nm-3 | |
| High magnification, three-axis micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | MHW-3 | |
| Peristaltic perfusion pump | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | PPS2 | |
| 2-channel temperature controller | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | TCO02 | |
| Square pulse stimulator | Natus Europe GmbH, Planegg, Germany | Grass SD9 | |
| Glass capillaries | WPI, Sarasota, USA | 1B150F-1 |
References
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