Методы экстракции эндосимбионтов из Белой бабочки<em> Bemisia tabaci</em
Summary
Здесь мы представляем протокол для выделения эндосимбионтов из белокрылки Bemisia tabaci посредством вскрытия и фильтрации. После амплификации образцы ДНК пригодны для последующего секвенирования и изучения взаимности между эндосимбионтами и белокрылой.
Abstract
Бактериальные симбионты формируют близкие отношения со своими хозяевами и придают преимуществам хозяевам в большинстве случаев. Геномная информация имеет решающее значение для изучения функций и эволюции бактериальных симбионтов у их хозяина. Поскольку большинство симбионтов нельзя культивировать in vitro , очень важны методы выделения достаточного количества бактерий для секвенирования генома. У белокрылки Bemisia tabaci был идентифицирован ряд эндосимбионтов и, как ожидается, будет иметь важное значение для развития и размножения вредителей с помощью множества подходов. Однако механизм, лежащий в основе ассоциаций, остается в значительной степени неизвестным. Препятствие частично связано с тем, что эндосимбионты в белокрылке, в основном сдерживаемые в бактериоцитах, трудно отделить от клеток-хозяев. Здесь мы сообщаем пошаговый протокол для идентификации, экстракции и очистки эндосимбионтов от белокрылки B. tabaci, главным образом, с помощью dissectiИ фильтрации. Образцы эндосимбионтов, полученные этим методом, хотя и представляют собой смесь разных видов эндосимбионтов, пригодны для последующего секвенирования генома и анализа возможных ролей эндосимбионтов в B. tabaci . Этот метод также может быть использован для выделения эндосимбионтов у других насекомых.
Introduction
Бактерии, формирующие интимную симбиотическую связь с относительными хозяевами, широко распространены у членистоногих 1 . Показано, что эндосимбионты влияют на аспекты хозяев, такие как метаболизм пищи, размножение, реакции на экологические стрессы 2 , 3 , 4 и т . Д. Практически на каждом этапе развития 5 . Однако механизм, лежащий в основе ассоциаций, по-прежнему остается в значительной степени неизвестным. Геномика имеет приоритет и значение при изучении потенциальных функций и ролей бактерий. Некоторая фундаментальная информация, то есть таксономический статус, функциональные гены, пути метаболизма, системы секреции, может быть выведена из последовательностей геномов, которая проливает свет на потенциальную роль симбионтов в симбиозе. С развитием высокопроизводительного секвенирования было выделено огромное количество бактериальных геномов wС различными функциями.
Эндосимбионты имеют жизненно важное значение в гемиптеранах, таких как тли 7 , клопы 8 , псиллиды 9 , коричневые кузнечики 10 и цикады 11 . Например, Buchnera в тлях , как обязательный симбионт, было продемонстрировано, что он участвует в биосинтезе незаменимых аминокислот наряду с генами из генома тли 12 . Кроме того, обнаружена транскрипционная регуляция Бухнера 13 . В psyllids Carsonella секвенируется и занимает наименьший бактериальный геном, когда-либо найденный 14 . Все эти признаки эндосимбионтов основаны и выведены из последовательностей геномов. Поскольку эти эндосимбионты нельзя культивировать in vitro , было применено несколько подходов для выделения адекватных бактерий для sequencing. В тлях эндосимбионты экстрагируют путем центрифугирования и фильтрации и подвергают дальнейшему геномному и транскриптомическому анализу 5 . В коричневых кузнечиках эндосимбионты секвенированы вместе с целым геномом 10 насекомых.
Whitefly B. tabaci – это видный комплекс, содержащий более 35 морфологически неразличимых видов (загадочные виды), среди которых два инвазивных вида вторглись во всем мире и нанесли огромный вред сельскохозяйственному производству 15 . Следует отметить, что эндосимбионты в видах B. tabaci показали важность в развитии вредителей 16 . На сегодняшний день в белокрылке идентифицированы восемь эндосимбионтов, в том числе облигатный симбионт, Candidatus Portiera aleyrodidarum и семь вторичных симбионтов Hamiltonella , Rickettsia , Arsenophonus , Cardinium , <Em> Wolbachia, Fritschea и Hemipteriphilus определены 17 , 18 .
В отличие от гемиптеранов, описанных ранее, белокрылка B. tabaci является чрезвычайно крошечным насекомым длиной всего 1 мм. Большинство эндосимбионтов ограничены бактериоцитами 19 (специализированные клетки, содержащие симбионты, которые далее образуют бактериому в B. tabaci ). Кроме того, эти эндосимбионты нельзя культивировать in vitro . Единственный способ получить эндосимбионты от B. tabaci – это вырезать бактериому. Тем не менее, есть трудности при вскрытии. Во-первых, хрупкая бактериома всегда связывается с другими тканями белокрылки, которую трудно разделить. Во-вторых, крошечный размер белокрылки ограничивает выделение достаточного количества бактерий. В-третьих, эндосимбионты группируются в бактериоме, что делает его чрезвычайно сложным для получения одного вида бактерий.
<p class = "jove_content"> Здесь мы сообщаем простой и недорогой протокол, чтобы изолировать эндосимбионты белых птиц для последующего секвенирования метагеном. Через вскрытие, очистку и амплификацию может быть получена адекватная эндосимбионтная ДНК и могут быть подтверждены виды бактерий. Описанный протокол можно использовать аналогично у других членистоногих.Protocol
Representative Results
Discussion
Since the endosymbionts within whiteflies cannot be cultured in vitro, dissection and assembling bacteriocytes is an effective way to obtain enough genetic material of endosymbionts. Before dissection, the species of whitefly and endosymbionts involved should be explicitly confirmed. The whitefly B. tabaci is a species complex with more than 35 morphologically indistinguishable species and different cryptic species may contain different endosymbionts. Portiera is uniformly harbored as an obliga…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансовая поддержка этого исследования была предоставлена Национальной ключевой программой исследований и разработок (2016YFC1200601) и Национальным научным фондом Китая (31390421).
Materials
| Taq DNA polymerase | Takara | R001A | including rTaq, 10×Buffer and dNTP |
| Gel DNA extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| DNA sample sequencing system | ABI | ABI-3730XL | |
| Microtome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7650 TEM | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| 20 μL microloader | Eppendorf | F2771951 | |
| Filter holder | Millipore | SX0001300 | |
| Filter membrane filter | Millipore | SMWP001300 | 5.0 μm SMWP |
| REPLI-g UltraFast Mini Kit | Qiagen | 150033 | DNA amlification kit |
| NanoDrop | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Genome Sequencer | Illumina | Hiseq 2000 |
References
- Buchner, P. Endosymbiosis of animals with plant microorganisms. J. Basic Microbiol. 7 (2), (1967).
- Sloan, D. B., Moran, N. A. Endosymbiotic bacteria as a source of carotenoids in whiteflies. Biol. Letters. 8 (6), 986-989 (2012).
- Stouthamer, R., Breeuwer, J. A., Hurst, G. D. Wolbachia pipientis: microbial manipulator of arthropod reproduction. Annu. Rev. Microbiol. 53, 71-102 (1999).
- Brumin, M., Kontsedalov, S., Ghanim, M. Rickettsia influences thermotolerance in the whitefly Bemisia tabaci B biotype. Insect Sci. 18 (1), 57-66 (2011).
- Hansen, A. K., Degnan, P. H. Widespread expression of conserved small RNAs in small symbiont genomes. ISME J. 8, 2490-2502 (2014).
- Moran, N. A., McCutcheon, J. P., Nakabachi, A. Genomics and evolution of heritable bacterial symbionts. Annu. Rev. Genet. 42, 165-190 (2008).
- Shigenobu, S., Watanabe, H., Hattori, M., Sakaki, Y., Ishikawa, H. Genome sequence of the endocellular bacterial symbiont of aphids Buchnera sp. APS. Nature. 407, 81-86 (2000).
- Nikoh, N., et al. Evolutionary origin of insect-Wolbachia nutritional mutualism. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (28), 10257-10262 (2014).
- Sloan, D. B., et al. Parallel histories of horizontal gene transfer facilitated extreme reduction of endosymbiont genomes in sap-feeding insects. Mol. Biol. Evol. 31 (4), 857-871 (2014).
- Xue, J., et al. Genomes of the rice pest brown planthopper and its endosymbionts reveal complex complementary contributions for host adaptation. Genome Biol. 15 (12), 521 (2014).
- Campbell, M. A., et al. Genome expansion via lineage splitting and genomereduction in the cicada endosymbiont Hodgkinia. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (33), 10192-10199 (2015).
- Wilson, A. C., et al. Genomic insight into the amino acid relations of the pea aphid, Acyrthosiphon pisum, with its symbiotic bacterium Buchnera aphidicola. Insect Mol. Biol. 19, 249-258 (2010).
- Degnan, P. H., Ochman, H., Moran, N. A. Sequence conservation and functional constraint on intergenic spacers in reduced genomes of the obligate symbiont Buchnera. PLoS Genet. 7 (9), e1002252 (2011).
- Nakabachi, A., et al. The 160-kilobase genome of the bacterial endosymbiont Carsonella. Science. 314 (5797), 267 (2006).
- De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annu. Rev. Entomol. 56, 1-19 (2011).
- Himler, A. G., et al. Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias. Science. 332 (6026), 254-256 (2011).
- Bing, X. L., Ruan, Y. M., Rao, Q., Wang, X. W., Liu, S. S. Diversity of secondary endosymbionts among different putative species of the whitefly Bemisia tabaci. Insect Sci. 20 (2), 194-206 (2013).
- Bing, X. L., Yang, J., Zchori-Fein, E., Wang, X. W., Liu, S. S. Characterization of a newly discovered symbiont of the whitefly Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae). Appl. Environ. Microbiol. 79 (2), 569-575 (2013).
- Kliot, A., et al. Fluorescence in situ hybridizations (FISH) for the localization of viruses and endosymbiotic bacteria in plant and insect tissues. J. Vis. Exp. (84), e51030 (2014).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923 (2012).
- Rao, Q., et al. Genome reduction and potential metabolic complementation of the dual endosymbionts in the whitefly Bemisia tabaci. BMC Genomics. 16 (1), 226 (2015).
- Thao, L. L., Baumann, P. Evolutionary relationships of primary prokaryotic endosymbionts of whiteflies and their hosts. Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3401-3406 (2004).
- Zhu, D. T., et al. Sequencing and comparison of the Rickettsia genomes from the whitefly Bemisia tabaci Middle East Asia Minor I. Insect Sci. 23 (4), 531-542 (2016).
- Gottlieb, Y., et al. Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (HomopteraAleyrodidae). Appl. Environ. Microbiol. 72 (5), 3646-3652 (2006).
- Zhang, C. R., et al. Differential temporal changes of primary and secondary bacterial symbionts and whitefly host fitness following antibiotic treatments. Sci. Rep. 5, 15898 (2015).
- Shan, H. W., et al. Temporal changes of symbiont density and host fitness after rifampicin treatment in a whitefly of the Bemisia tabaci species complex. Insect Sci. 23 (2), 200-214 (2016).
- Zchori-Fein, E., Brown, J. K. Diversity of prokaryotes asscociated with Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 95 (6), 711-718 (2002).
- Thao, M. L., Baumann, P. Evolutionary relationships of primary prokaryotic endosymbionts of whiteflies and their hosts. Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3401-3406 (2004).
- Zchori-Fein, E., Perlman, S. J. Distribution of the bacterial symbiont Cardinium in arthropods. Mol. Ecol. 13 (7), 2009-2016 (2004).
- O’Neill, S. L., Giordano, R., Colbert, A. M., Karr, T. L., Robertson, H. M. 116S rRNA phylogenetic analysis of the bacterial endosymbionts associated with cytoplasmic incompatibility in insects. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 (7), 2699-2702 (1992).
- Nirgianaki, A. Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 47 (2), 93-101 (2003).
- Everett, K. D., Thao, M. L., Horn, M., Dyszynski, G. E., Baumann, P. Novel chlamydiae in whiteflies and scale insects: endosymbionts ‘Candidatus Fritschea bemisiae’ strain Falk and ‘Candidatus Fritschea eriococci’ strain Elm. Int. J. Syst. Evol. Micr. 55, 1581-1587 (2005).
