Пищевых патогенов скрининга с помощью магнитно люминесцентные нано: Быстрое обнаружение кишечной палочки O157: H7
Summary
Общая цель настоящего Протокола заключается в синтезировать функциональных Наносенсоры для портативных, экономически эффективным, и быстрое обнаружение конкретно болезнетворные бактерии через сочетание Магнитная релаксация и флуоресценции выбросов условий.
Abstract
Энтерогеморрагические кишечной палочки O157: H7 был связан с оба водного и болезней пищевого происхождения, так и остается угрозой несмотря на методы отбора пищи и воды в настоящее время используется. Во время обычных бактериальных обнаружения методов таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР) и энзим соединенный иммуноферментного анализа (ИФА) конкретно может обнаружить патогенных загрязнителей, они требуют обширной пробоподготовки и длительных периодов ожидания. Кроме того эти методы требуют сложных лабораторных инструментов и параметров и должна выполняться квалифицированными специалистами. Здесь протокол предлагается для простой диагностики техника, которая имеет уникальное сочетание параметров магнитных и флуоресцентные в платформу на основе наночастиц. Предлагаемая многопараметрических магнито люминесцентные Наносенсоры (MFnS) можно обнаружить кишечной палочки O157: H7 загрязнения как 1 колонии формирование подразделения в раствор в течение менее 1 ч. Кроме того, MFnS способность оставаться весьма функциональный в сложных средах, таких как молоко и воды озера была проверена. Дополнительные специфика анализов использовались также для демонстрации способности MFnS только обнаружить конкретные целевые бактерий, даже при наличии аналогичных видов бактерий. Спаривание магнитных и люминесцентные методы позволяет для выявления и количественной оценки загрязнения возбудителя в широком диапазоне концентраций, экспонирования его высокая производительность в обоих ранней и поздней стадии обнаружения загрязнения. Эффективности, доступности и переносимости MFnS делают их идеальным кандидатом для точки обслуживания скрининга для бактериальных загрязнений в широком диапазоне параметров, от водных резервуаров для коммерчески упакованных пищевых продуктов.
Introduction
Стойких возникновения бактериального загрязнения в оба коммерчески производства продуктов питания и источники воды создала потребность в более быстрых и конкретных диагностики платформ. 1 , 2 некоторые из более общих бактериальных загрязнений, ответственность за загрязнение пищи и воды, от сальмонеллы, стафилококки, Listeria, Vibrio, Shigella, родов Bacillus и Escherichia. 3 , 4 бактериального загрязнения этими патогенами часто приводит к симптомы, как лихорадка, холера, гастроэнтерит и понос. 4 загрязнение источников воды часто имеет радикальные и негативное воздействие на общины без доступа к достаточно фильтрованной воды, и загрязнение продуктов питания привела к большое количество заболеваний и усилия отозвания продукта. 5 , 6
Для того, чтобы уменьшить возникновение заболеваний, вызванных бактериального загрязнения, были ряд усилий по разработке методов, которыми воды и пищи можно эффективно сканировать до продажи или потребления. 3 методы, такие как ПЦР, ИФА,11,12 цикла опосредованной изотермической амплификация (1,7,8,9,10 ЛАМПА),14 13,среди прочего,15,16,,1718,19,20,21, 22,,2324 недавно были использованы для обнаружения различных возбудителей. По сравнению с традиционными бактериальных культивирования методов, эти методы являются гораздо более эффективным в отношении конкретности и время. Однако эти методы до сих пор борьба с ложных срабатываний и негативы, сложные процедуры и стоимость. 1 , 3 , 25 именно по этой самой причине, что многопараметрических магнито люминесцентные Наносенсоры (MFnS) предлагается как альтернативный метод для обнаружения бактерий.
Эти Наносенсоры уникально пара вместе Магнитная релаксация и люминесцентные методы, позволяя двойной обнаружения платформы, которая является быстрой и точной. Как пример загрязнения с помощью кишечной палочки O157: H7, свидетельствует MFnS способность обнаруживать кое как 1 в течение нескольких минут. Возбудитель специфические антитела используются для увеличения специфичности, и сочетание как магнитные, так и люминесцентные методы позволяет для обнаружения и количественного определения бактериальных загрязнений в обоих диапазонах низкого и высокого загрязнения. 16 в случае бактериального загрязнения, Наносенсоры будут роиться вокруг бактерии из-за ориентации способностей возбудителя специфических антител. Привязку между магнитным Наносенсоры и бактерии ограничивает взаимодействие между магнитным железное ядро и окружающие воды протонов. Это приводит к увеличению в T2 времени релаксации, как записано в магнитных релаксометр. Как повышается концентрация бактерий в растворе, Наносенсоры расходятся с увеличение количества бактерий, что приводит к более низкие значения T2. И наоборот флуоресценции выбросов будет увеличиваться пропорционально концентрации бактерий, в связи с увеличением числа Наносенсоры непосредственно привязаны к патогена. Центрифугирования образцов и изоляции бактериальной Пелле, только сохранит наночастиц, непосредственно подключенные к бактерии, удаление любого свободного плавающего Наносенсоры и непосредственно корреляция выбросов флуоресценции с числом бактерии, присутствующие в растворе. Схематическое представление этого механизма представлена на рисунке 1.
Эта платформа MFnS был разработан с точки обслуживания скрининга в виду, в результате характеристики лоу кост и портативный. MFnS стабильны при комнатной температуре и требуется только в очень низких концентрациях для точного обнаружения бактериальных загрязнений. Кроме того после синтеза, использование MFnS прост и не требует использования квалифицированных специалистов в этой области. Наконец это диагностическая платформа позволяет высоко настраиваемый ориентации, предоставляя средства, которых это одна платформа может использоваться для выявления возбудителей всех видов, в много различных настроек.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол был разработан для получения полностью функциональной MFnS как просто как можно скорее. Однако есть много ключевых моментов, на которые изменения протокола может быть полезным, в зависимости от конечной цели пользователя. Например использование различны?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддерживается P20GM103418 K-INBRE, Канзас сои Комиссией (KSC/БП 1663), ACS PRF 56629-UNI7 и БП полимерной химии запуска фонда, все СС. Мы благодарим университета видеооператор, г-н Якоб Anselmi, за его выдающуюся работу с видео. Мы также благодарим г-н Роджер Heckert и миссис Катха Heckert за их щедрую поддержку для проведения исследований.
Materials
| Ferrous Chloride Tetrahydrate | Fisher Scientific | I90-500 | |
| Ferric Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | I88-500 | |
| Ammonium Hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Polyacryllic Acid | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| EDC | Thermofisher Scientific | 22980 | |
| NHS | Fisher Scientific | AC157270250 | |
| Anti-E. coli O111 antibody | sera care | 5310-0352 | |
| Anti-E. coli O157:H7 antibody [P3C6] | Abcam | ab75244 | |
| DiI Stain | Fisher Scientific | D282 | |
| Nutrient Broth | Difco | 233000 | |
| Freeze-dried E. coli O157:H7 pellet | ATCC | 700728 | |
| Magnetic Relaxomteter | Bruker | mq20 | |
| Zetasizer | Malvern | NANO-ZS90 | |
| Plate Reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Magnetic Column | QuadroMACS | 130-090-976 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 Series | |
| Centrifuge (accuSpin Micro 17) | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| Floor Model Shaking Incubator | SHEL LAB | SSI5 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | ME104E | |
| Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Open-Air Rocking Shaker | Fisher Scientific | 02-217-765 |
References
- Law, J. W., Ab Mutalib, N. S., Chan, K. G., Lee, L. H. Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens: principles, applications, advantages and limitations. Front Microbiol. 5, 770 (2014).
- Pandey, P. K., Kass, P. H., Soupir, M. L., Biswas, S., Singh, V. P. Contamination of water resources by pathogenic bacteria. AMB Express. 4, 51 (2014).
- Zhao, X., Lin, C. W., Wang, J., Oh, D. H. Advances in rapid detection methods for foodborne pathogens. J Microbiol Biotechnol. 24 (3), 297-312 (2014).
- Heithoff, D. M., et al. Intraspecies variation in the emergence of hyperinfectious bacterial strains in nature. PLoS Pathog. 8 (4), e1002647 (2012).
- Ishii, S., Sadowsky, M. J. Escherichia coli in the Environment: Implications for Water Quality and Human Health. Microbes Environ. 23 (2), 101-108 (2008).
- Chiou, C. S., Hsu, S. Y., Chiu, S. I., Wang, T. K., Chao, C. S. Vibrio parahaemolyticus serovar O3:K6 as cause of unusually high incidence of food-borne disease outbreaks in Taiwan from 1996 to 1999. J Clin Microbiol. 38 (12), 4621-4625 (2000).
- Zhou, G., et al. PCR methods for the rapid detection and identification of four pathogenic Legionella spp. and two Legionella pneumophila subspecies based on the gene amplification of gyrB. Appl Microbiol Biotechnol. 91 (3), 777-787 (2011).
- Chen, J., Tang, J., Liu, J., Cai, Z., Bai, X. Development and evaluation of a multiplex PCR for simultaneous detection of five foodborne pathogens. J Appl Microbiol. 112 (4), 823-830 (2012).
- LeBlanc, J. J., et al. Switching gears for an influenza pandemic: validation of a duplex reverse transcriptase PCR assay for simultaneous detection and confirmatory identification of pandemic (H1N1) 2009 influenza virus. J Clin Microbiol. 47 (12), 3805-3813 (2009).
- Mahony, J. B., Chong, S., Luinstra, K., Petrich, A., Smieja, M. Development of a novel bead-based multiplex PCR assay for combined subtyping and oseltamivir resistance genotyping (H275Y) of seasonal and pandemic H1N1 influenza A viruses. J Clin Virol. 49 (4), 277-282 (2010).
- Alvarez, M. M., et al. Specific recognition of influenza A/H1N1/2009 antibodies in human serum: a simple virus-free ELISA method. PLoS One. 5 (4), e10176 (2010).
- Huang, C. J., Dostalek, J., Sessitsch, A., Knoll, W. Long-range surface plasmon-enhanced fluorescence spectroscopy biosensor for ultrasensitive detection of E. coli O157:H7. Anal Chem. 83 (3), 674-677 (2011).
- Zhang, J., et al. Rapid visual detection of highly pathogenic Streptococcus suis serotype 2 isolates by use of loop-mediated isothermal amplification. J Clin Microbiol. 51 (10), 3250-3256 (2013).
- Han, F., Wang, F., Ge, B. Detecting potentially virulent Vibrio vulnificus strains in raw oysters by quantitative loop-mediated isothermal amplification. Appl Environ Microbiol. 77 (8), 2589-2595 (2011).
- Wang, J., et al. Rapid detection of pathogenic bacteria and screening of phage-derived peptides using microcantilevers. Anal Chem. 86 (3), 1671-1678 (2014).
- Banerjee, T., et al. Multiparametric Magneto-fluorescent Nanosensors for the Ultrasensitive Detection of Escherichia coli O157:H7. ACS Infect Dis. 2 (10), 667-673 (2016).
- Shelby, T., et al. Novel magnetic relaxation nanosensors: an unparalleled "spin" on influenza diagnosis. Nanoscale. 8, 19605-19613 (2016).
- Bui, M. P., Ahmed, S., Abbas, A. Single-Digit Pathogen and Attomolar Detection with the Naked Eye Using Liposome-Amplified Plasmonic Immunoassay. Nano Lett. 15 (9), 6239-6246 (2015).
- Farnleitner, A. H., et al. Rapid enzymatic detection of Escherichia coli contamination in polluted river water. Lett Appl Microbiol. 33 (3), 246-250 (2001).
- Huh, Y. S., Lowe, A. J., Strickland, A. D., Batt, C. A., Erickson, D. Surface-enhanced Raman scattering based ligase detection reaction. J Am Chem Soc. 131 (6), 2208-2213 (2009).
- Jayamohan, H., et al. Highly sensitive bacteria quantification using immunomagnetic separation and electrochemical detection of guanine-labeled secondary beads. Sensors (Basel). 15 (5), 12034-12052 (2015).
- Kaittanis, C., Naser, S. A., Perez, J. M. One-step, nanoparticle-mediated bacterial detection with magnetic relaxation. Nano Lett. 7 (2), 380-383 (2007).
- Meeker, D. G., et al. Synergistic Photothermal and Antibiotic Killing of Biofilm-Associated Staphylococcus aureus Using Targeted Antibiotic-Loaded Gold Nanoconstructs. ACS Infect Dis. 2 (4), 241-250 (2016).
- Wang, Y., Ye, Z., Si, C., Ying, Y. Subtractive inhibition assay for the detection of E. coli O157:H7 using surface plasmon resonance. Sensors (Basel). 11 (3), 2728-2739 (2011).
- Zhao, X., et al. A rapid bioassay for single bacterial cell quantitation using bioconjugated nanoparticles. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (42), 15027-15032 (2004).
