التصور من محور الإسقاط نمط من الخلايا العصبية المحرك الجنينية في<em> ذبابة الفاكهة</em
Summary
هذا العمل تفاصيل طريقة المناعية القياسية لتصور توقعات الخلايا العصبية الحركية من أواخر المرحلة 16 الأجنة ميلانوجاستر ذبابة الفاكهة . إعداد فيليه من الأجنة ثابتة ملطخة الأجسام المضادة فاسي يوفر أداة قوية لتوصيف الجينات المطلوبة لمحور محور عصبي باثفيندينغ والاعتراف الهدف خلال التنمية العصبية.
Abstract
إنشاء الدوائر العصبية والعضلية وظيفية تعتمد على اتصالات دقيقة بين محاور تطوير المحرك والعضلات المستهدفة. الخلايا العصبية موتور توسيع المخاريط النمو للتنقل على طول مسارات محددة من خلال الاستجابة لعدد كبير من العظة التوجيه المحاور التي تنبعث من البيئة خارج الخلية المحيطة بها. نمو مخروط الهدف الاعتراف أيضا يلعب دورا حاسما في خصوصية العصبية والعضلية. يقدم هذا العمل بروتوكول المناعية القياسية لتصور توقعات الخلايا العصبية الحركية من أواخر المرحلة 16 الأجنة ميلانوجاستر ذبابة الفاكهة . ويشمل هذا البروتوكول بضع خطوات رئيسية، بما في ذلك إجراء التنميط الجيني، لفرز الأجنة متحولة المطلوب. إجراء إمونوستينينغ، لوضع علامة الأجنة مع فاسيكلين الثاني (فاسي) الأجسام المضادة. وإجراء تشريح، لتوليد الاستعدادات فيليه من الأجنة الثابتة. توقعات المحاور الحركية وأنماط العضلات في المحيط هي أفضل بكثير تصور في الاستعدادات مسطحة من الأجنة فيليه من في وأولي جبل الأجنة. ولذلك، فإن إعداد شرائح من الأجنة ثابتة ملطخة الأجسام المضادة فاسي يوفر أداة قوية لتوصيف الجينات المطلوبة لالمحور محور الباطنة والاعتراف الهدف، ويمكن أيضا أن تطبق على كل من فقدان من وظيفة وكسب وظيفة من الشاشات الوراثية .
Introduction
وصلات دقيقة والانتقائية بين المحاور الحركية والعضلات المستهدفة خلال التطور الجنيني ضرورية للحركة العادية في يرقات ذبابة الفاكهة . يتم إنشاء الزخرفة الجنينية من 30 ألياف العضلات في كل من هيميسيغمينتس البطن A2-A7 من قبل المرحلة 16 1 . الخلايا العصبية الحركية 36 التي يتم إنشاؤها في الحبل العصب البطني تمديد محاورهم في محيط لعصبية عضلات الهدف محددة 2 . يمكن أن تصور المحرك محور عصبي الباثل والاعتراف الهدف من قبل المناعية مع الأجسام المضادة (الماوس 1C4 الأجسام المضادة 1) 4 ، 4 . صور متعددة من أنماط الإسقاط محور عصبي المحرك في الأجنة ويلديب متاحة على شبكة الإنترنت 5 . يصف الجسم المضاد 1D4 جميع المحاور الحركية وثلاث كراسات محورية طولية على كل جانب من خط الوسط للجهاز العصبي المركزي الجنيني (نس) 4 </sحتى> ، 6 ( الشكل 1C والشكل 2A ). ولذلك، المناعية مع الأجسام المضادة فاسي يوفر أداة قوية لتحديد الجينات المطلوبة للاتصال العصبية والعضلية لإثبات الآليات الجزيئية الكامنة وراء التوجيه محور عصبي المحرك والاعتراف الهدف.
في كل من هيميسيغمينتس البطن A2-A7، ومحاور محور عصبي المشروع وفاسيكولاتي انتقائي إلى اثنين من فروع الأعصاب الرئيسية، والعصب القطعي (سن) والعصب بين الأوعية (إيسن) 2 ، 4 ، وفرع الأعصاب طفيفة، والعصب المستعرض (تن ) 7 . ويتحلل ال سن بشكل انتقائي ليؤدي إلى فرعين عصبيين يطلق عليهما سنا و شنك، في حين تنقسم إيسن إلى ثلاثة فروع عصبية تسمى إيسن و إيسنب و إيسند 2 ، 4 . من بينها، إيسن، إيسنب، و سنا محور عصبي المحركيتم تصور أنماط الإسقاط على وجه التحديد عندما تكون ملطخة المرحلة المتأخرة 16 الأجنة مع الأجسام المضادة فاسي ويتم فيليتد ( الشكل 1C والشكل 2A ). الخلايا العصبية الحركية إيسن تمتد محاورها إلى عضلات الظهرية العصبية 1، 2، 3، 4، 9، 10، 11، 18، 19، و 20 2 ، 4 ( الشكل 2A ). الخلايا العصبية الحركية إيسنب العصبية عضلات بطني 6 و 7 و 12 و 13 و 14 و 28 و 30 2 و 4 ( الشكل 2A و 2 B). مشاريع فرع العصب سنا لعضلات العضلات العصبية 5، 8، 21، 22، 23، و 24 2 ، 4 ( الشكل 2A ). تن، التي تتكون من محاور اثنين من المحركات، والمشاريع إبسيلاتيرالي على طول الحدود القطاعية إلى العضلات العصبية 25 ويجعل نقاط الاشتباك العصبي مع العصبية الشريان القطباني الجانبي الجانبي (لبد) فيمحيط 7 ( الشكل 2A ). هذه الأعصاب العضلات المستهدفة تتطلب ليس فقط التصفية انتقائية للمحاور الحركية في نقاط اختيار محددة، ولكن أيضا تستهدف التعرف على العضلات. وبالإضافة إلى ذلك، تم العثور على بعض الخلايا المفترضة الأديم المتوسط الأديم التي تعمل كأهداف وسيطة في كل من مسارات إيسن و سنا، ولكن ليس على طول مسار إيسنب 4 . وهذا قد يوحي بأن إسنب المحرك محور عصبي يمكن تنظيمها بطريقة متميزة بالمقارنة مع إيسن و سنا التوجيه محور عصبي المحرك، وأنه يشير أيضا إلى أن التوجيه المحوري محور عصبي يوفر نموذج تجريبي جذابة لدراسة الأدوار التفاضلية أو الحفاظ على جديلة التوجيه واحد الجزيء 8 .
يقدم هذا العمل طريقة قياسية لتصور أنماط الإسقاط محور عصبي من الخلايا العصبية الحركية الجنينية في ذبابة الفاكهة . وتشمل البروتوكولات وصفها كيفية تشريح الأجنة ثابتة ملطخة 1D4 أنتيبودي ومعالجتها في 3،3'-ديامينوبنزيدين (داب) للاستعدادات فيليه. واحدة من المزايا الحرجة للاستعدادات مسطحة من الأجنة الثابتة هو التصور أفضل من الإسقاطات محور عصبي وأنماط العضلات في المحيط. وعلاوة على ذلك، يظهر هذا العمل أيضا كيفية التركيب الوراثي الأجنة ثابتة لفرز الأجنة الطافرة المطلوب باستخدام طريقة تلطيخ لاش.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتم تسجيل تفاصيل عيوب التوجيه محور عصبي المحرك بشكل أسرع ومع دقة أفضل من قبل إعداد شرائح من الأجنة الملطخة داب من المسح الضوئي المجهري متحد البؤر الليزر من تلك المسمى فلورزنتلي. ولذلك، فإن إعداد شرائح من الأجنة الثابتة و 1 D4 الملون هو الأنسب لتوصيف وظيفي للجزيئات جدي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أشكر أليكس L. كولودكين، كما تعلمت هذا البروتوكول إعداد فيليه مختبره. وأود أيضا أن أشكر الشباب جي هونغ للمساعدة التقنية. وقد دعمت هذه الدراسة من قبل جبهة الخلاص الوطني 2013R1A1A4A01011329 (سج).
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Ted Pella | 18505 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | 71500 | |
| X-Gal Substrate | US Biological | X1000 | X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside) |
| Dimethyl Sulfxide | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Potassium hexacyanoferrate(III) | Sigma-Aldrich | 244023 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| 3,3'-diaminobenzidine Tetrahydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| Agar | US Biological | A0930 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate) | Sigma-Aldrich | H5501 | |
| Culture Dish (60 mm) | Corning | 430166 | |
| Tricon Beaker | Simport | B700-100 | This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection. |
| Yeast | Societe Industrielle Lesaffre | Saf Instant Yeast Red | |
| Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100) | VWR | 14220-263 | |
| Eppendorf Tube (1.5 ml) | Sarstedt | #72.690 | |
| Bleach | The Clorox Company | Clorox | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | 246654 | |
| Methanol | J.T. Baker | UN1230 | |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Anti-FasciculinII Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4 anti-Fasciclin II | |
| Goat Anti-mouse-HRP Antibody | Jackson Immunoresearch | 115-006-068 | AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Slide Glass | Duran Group | 235501403 | |
| Coverslip | Duran Group | 235503104 | 18 x 18 mm |
| 1 ml Syringe | Becton Dickinson Medical(s) | 301321 | |
| Tungsten Needle | Ted Pella | #27-11 | Tungsten Wire, ø0.13mm/6.1m (ø.005"/20 ft.) |
| Nutator (Mini twister) | Korean Science | KO.VS-96TWS | Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125) |
References
- Bate, M. The embryonic development of larval muscles in Drosophila. Development. 110 (3), 791-804 (1990).
- Landgraf, M., Thor, S. Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology. Semin. Cell Dev. Biol. 17 (1), 3-11 (2006).
- Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule. Cell. 67 (1), 45-57 (1991).
- Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila. Cell. 73 (6), 1137-1153 (1993).
- . Available from: https://www.its.caltech.edu/~zinnlab/motoraxons.html (2017)
- Seeger, M., Tear, G., Ferres-Marco, D., Goodman, C. S. Mutations affecting growth cone guidance in Drosophila: genes necessary for guidance toward or away from the midline. Neuron. 10 (3), 409-426 (1993).
- Thor, S., Thomas, J. B. The Drosophila islet gene governs axon pathfinding and neurotransmitter identity. Neuron. 18 (3), 397-409 (1997).
- Roh, S., Yang, D. S., Jeong, S. Differential ligand regulation of PlexB signaling in motor neuron axon guidance in Drosophila. Int. J. Dev. Neurosci. 55, 34-40 (2016).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. . The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).
- Patel, N. H., Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods in cell biology, vol 44. Drosophila melanogaster: practical uses in cell biology. 44, 445-487 (1994).
- Lee, H. K., Wright, A. P., Zinn, K. Live dissection of Drosophila embryos: streamlined methods for screening mutant collections by antibody staining. J. Vis. Exp. (34), (2009).
- Hartenstein, V. Stages of Embryonic Development. Atlas of Drosophila. development. , 52 (1993).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull. World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
- Kolodkin, A. L. Fasciclin IV: sequence, expression, and function during growth cone guidance in the grasshopper embryo. Neuron. 9 (5), 831-845 (1992).
- Jeong, S., Juhaszova, K., Kolodkin, A. L. The Control of semaphorin-1a-mediated reverse signaling by opposing pebble and RhoGAPp190 functions in Drosophila. Neuron. 76 (4), 721-734 (2012).
- Winberg, M. L. Plexin A is a neuronal semaphorin receptor that controls axon guidance. Cell. 95 (7), 903-916 (1998).
- Yang, D. S., Roh, S., Jeong, S. The axon guidance function of Rap1 small GTPase is independent of PlexA RasGAP activity in Drosophila. Dev. Biol. 418 (2), 258-267 (2016).
- Yu, H. H., Araj, H. H., Ralls, S. A., Kolodkin, A. L. The transmembrane Semaphorin Sema I is required in Drosophila for embryonic motor and CNS axon guidance. Neuron. 20 (2), 207-220 (1998).
- Hartenstein, V. Stages of Embryonic Development. Atlas of Drosophila. development. , 52 (1993).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Kidd, T. Roundabout controls axon crossing of the CNS midline and defines a novel subfamily of evolutionarily conserved guidance receptors. Cell. 92 (2), 205-215 (1998).
- Pasterkamp, R. J. Getting neural circuits into shape with semaphorins. Nat. Rev. Neurosci. 13 (9), 605-618 (2012).
